РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об'єкт досліджень
Об'єктом досліджень були етіольовані п’ятидобові проростки озимої пшениці
(Triticum aestivum L.) сорту Миронівська 61 (національний стандарт).
Особливості сорту Миронівська 61: високопродуктивність, стабільність за
врожайністю, висока стійкість до вилягання й обсипання, висока зимостійкість,
середня посухостійкість, висока регенераційна здатність. Широко
використовується в сільському господарстві України, Білорусії та Росії.
Відповідно до прийнятої вікової періодизації життєвого циклу пшениці [74]
досліджувані п’ятидобові проростки належать до другого вікового періоду –
стадії формування проростка, тривалість якої у пшениці варіює від 5 до 15 діб.
Усі органи в цей період – корінь, листки, зародкове стебло – є зародковими, що
утворилися за рахунок материнських речовин насінини.
2.2. Характеристика умов експерименту
Насіння пшениці замочували протягом 5-6 годин і вирощували в плошках у темряві
в термостаті при температурі +24 ?С. Після досягнення проростками 5-добового
віку для досліджування впливу гамма-радіації рослини ставили в камеру
кобальтової установки “Исследователь” (Росія), де їх піддавали одноразовому
опроміненню в дозах 0,5; 1; 1,5; 3; 5; 7; 10; 15; 30; 50 і 100 Гр при
потужності дози 0,048 Гр/с. Для дослідження впливу теплового шоку частину
рослин витримували протягом 2 годин при температурі +40-42 ?С. Вибір високої
позитивної температури зроблено на підставі даних літератури. Решта рослинного
матеріалу була контролем.
2.3. Методи мікроскопії
Для анатомічних досліджень сегменти з центральної частини першого листка (не
менше 3-х проростків для кожного варіанта) фіксували водним розчином 3%
глутаральдегіду (рН 7,4) та 1% чотириоксиду осмію за загально прийнятою
методикою [105]. Фіксований матеріал зневоднювали у серії спиртів зростаючих
концентрацій, переводили в абсолютний ацетон і вміщували у суміш епоксидних
смол: епон 812 – 12 мл, аральдит М – 9 мл, ДДСА –12 мл, МНА – 6 мл. Для
прискорення полімеризації у вказану суміш смол вносили каталізатор ДНП (7-30
крапель). Поперечні зрізи товщиною 1 мкм виготовляли на мікротомі LKB 8800,
переносили на предметні скельця й фарбували 1% розчином метиленового
блакитного. Препарати аналізували на мікроскопі NU-2 (25 Ч 4) протягом 3-х діб
після дії негативних чинників. Ультратонкі поперечні зрізи товщиною 40-50 нм
отримували на ультрамікротомі LKBІІІ, знімали на сіточки та контрастували 1%
водним розчином уранілацетату протягом 20 хвилин і розчином цитрату свинцю (20
хвилин) за методом Рейнольдса [193]. Знімки робили на електронному мікроскопі
JEM-100 (JEOL, Японія), пряме збільшення 5-10 тис.
2.4. Метод радіоактивного мічення рослин
Для радіоактивного мічення зрізали надземну частину 20-25 проростків,
подрібнювали та інкубували в 1,5 мл розчину суміші 14С-амінокислот (питома
активність 4 МБк//мл) протягом 4 годин при температурі +24 °°С. Частину
матеріалу використовували для отримання сумарної фракції поліпептидів, із решти
виділяли Мх.
Радіоактивність зразків визначали за допомогою рідинного сцинтиляційного
лічильника Бета-2 (Україна) або LKB 1211 Rackbeta (Швеція).
Концентрацію білка визначали за методом Лоурі [156].
2.5. Методи виділення органел клітин
2.5.1. Метод виділення мітохондрій
Мітохондрії отримували за допомогою модифікованого методу диференціального
центрифугування [78, 112]. Зрізані стебла проростків
(2 г) подрібнювали ножицями на шматочки довжиною 3–5 мм і розтирали в
охолодженій ступці з 12 мл розчину 1, що містив 300 мМ сахарози, 50 мМ трис-HCl
(pH 8,0), 3 мМ трилону Б, 0,2% бичачого сироваткового альбуміну, 1%
поліетиленгліколю (мол. м. 4000), 10 мМ фосфату калію та 0,1 мМ
b-меркаптоетанолу. Гомогенат фільтрували через тканину і центрифугували
протягом 10 хвилин при 400 об/хв у роторі 6х85 (центрифуга VAC-602,
Німеччина).
Супернатант акуратно наносили у центрифужні пробірки, що містили 18 мл розчину
2 такого складу: 600 мМ сахарози, 25 мМ трис-HCl (pH 7,5), 0,1% бичачого
сироваткового альбуміну, 1 мМ хлориду магнію, 1 мМ фосфату калію та 0,1 мМ
b-меркаптоетанолу. Центрифугували протягом 30 хвилин у бакет-роторі 3х30 при 12
тис. об/хв. Осад суспензіювали з 10 мл розчину 3, до складу якого входили: 300
мМ сахарози, 25 мМ трис-HCl (pH 7,5), 1 мМ хлориду магнію, 1 мМ фосфату калію
та 0,05 мМ b-меркаптоетанолу. Центрифугували протягом 15 хвилин у роторі 6х11
при 14 тис. об/хв, супернатант зливали, а до осаду Мх додавали 60 мкл
подвійного буфера Леммлі [147] такого складу: 125 мМ трис-HCl (pH 6,8), 0,5%
b-меркаптоетанол, 2% гліцерин, 2% додецилсульфат натрію (ДДСН) і бромфеноловий
синій у слідовій кількості.
2.5.2. Метод виділення ядер
Виділення ядер здійснювали за методом [57], який забезпечує вихід ядер до 30%.
Надземну частину 20-25 проростків подрібнювали та розтирали в охолодженій
ступці, попередньо додаючи розчин I (50% гліцерин, 1 мМ MgCl2·6H2O, 2 мМ CaCl2,
20 мМ трис, 0,05% тритон Х-100, рН 7,8). До гомогенату додавали 15 мл розчину 2
(1 мМ MgCl2·6H2O, 2 мМ CaCl2, 20 мМ трис, рН 7,8) і залишали для відстоювання
на 40 хвилин Неочищену суспензію ядер відбирали шприцом, а осад суспендували в
15 мл розчину 1. Потім процедуру руйнування клітин повторювали. Отриману таким
же чином другу суспензію ядер об'єднували з першою і фільтрували через 4 шари
тонкої капронової тканини. Фільтрат центрифугували при 700 g протягом 20
хвилин. Супернатант відкидали, а осад ядер суспендували у розчині 3 (суміш
розчинів 1 та 2 у співвідношенні 1:1) і центрифугували при 700 g протягом 20
хвилин. Далі осад
- Київ+380960830922