РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Характеристика обследованных больных
В работе приведен материал по обследованию 117 больных В-ХЛЛ в III стадии заболевания по классификации Rai, лечившихся в отделении заболеваний системы крови Института гематологии и трансфузиологии АМН Украины в период с 1999 по 2002 года. Среди обследованных лиц было 72 мужчин и 45 женщин (рис.2.1) в возрасте от 33 до 83 лет, средний возраст составлял 61,7±1,1 лет.
Рис. 2.1. Распределение по полу исследованных больных
Диагноз В-клеточного хронического лимфолейкоза был поставлен на основании определения иммунофенотипа субстратных клеток - экспрессии на поверхности лейкемических лимфоцитов дифференцировочных антигенов - HLA-DR, CD19, CD20, CD24 и CD5, CD23. Эти исследования проводились в отделе иммуноцитохимии Института экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е.Кавецкого, руководитель Д.Ф.Глузман.
Согласно международной классификации все больные были разделены по возрасту на 4 группы:
- первая группа (молодого возраста) - от 30 до 44 лет;
- вторая (зрелого возраста) - от 45 до 59 лет;
- третья (пожилого возраста) - от 60 до 74 лет;
- четвертая (старческого возраста) - от 75 до 89 лет.
Группу молодого возраста составили 17 человек, зрелого - 28, пожилого - 50 и старческого 22 человека. Распределение больных по возрастным группам отражено на рис. 2.2.
Рис.2.2. Распределение больных по возрастным группам
Все исследования проводились до назначения курсов химиотерапии или в перерывах между ними.
При обследовании больных большое внимание уделялось анализу анамнестических данных, выявлению первых клинических и гематологических проявлений заболевания, определению периода от начала их появления до установления диагноза и начала химиотерапии, изучению сопутствующей патологии. При этом использовались материалы амбулаторной и стационарной документации.
2.2. Методы исследования
В процессе работы были использованы гематологические, иммунологические, биохимические, гистологические и цитохимические методы исследования.
Проводилось общеклиническое обследование органов и систем больных с определением размеров лимфатических узлов, печени, селезенки с помощью пальпации, перкуссии, а также ультразвукового исследования.
Всем больным проводили биохимическую оценку функции почек, печени, используя унифицированные методы исследования [155].
Для изучения состояния гемопоэза у больных В-ХЛЛ использовали следующие методы.
Оценка показателей периферической крови по данным гемограмм (определение количества гемоглобина, эритроцитов, ретикулоцитов, тромбоцитов, подсчет лейкоцитарной формулы).
Оценивались морфологические особенности клеток периферической крови и костномозгового пунктата в мазках, окрашенных по Паппенгейму.
Изучение костномозгового пунктата с подсчетом общего количества миелокариоцитов, процентного содержания клеток различных ростков кроветворения, лейкоэритроидного соотношения, парциальной эритробластограммы, позволившей учитывать сдвиги в каждом ряду эритроидных клеток.
Проводилось гистологическое исследование трепанобиоптатов костного мозга подвздошной кости [156]. Гистологические срезы окрашивались гематоксилином и эозином, по методу ван Гизон, азур II эозином, проводилась импрегнация солями азотно-кислого серебра по Гомори для выявления ретикулярных волокон.
Для выявления качественных нарушений эритрокариоцитов использовали цитохимический метод определения полисахаридов в ядросодержащих клетках костного мозга (PAS-реакция) по методу Мак-Мануса и Хочкисса. В костном мозге здорового человека PAS-положительные эритроидные предшественники определяются в небольшом количестве (3-8 %). Повышение этого показатели при наличии анемии и отсутствии ретикулоцитоза в периферической крови указывает на развитие "неэффективного" эритропоэза [97, 98].
Для изучения причин гемолиза проводили иммунологическое исследование: определение аутоиммунных антиэритроцитарных антител методом микротипирующей гелевой технологии [157]. Метод основан на осаждении агглютинатов в агаровом геле "SEPHADEX", помещенном в микропробирки. ID-карты ДиаМед представляют собой пластиковые карточки, в которые встроены 6 пробирок, содержащих гель. В трех пробирках, расположенных слева, содержится гель и антиглобулиновая сыворотка к Ig человека. Эти пробирки предназначены для выявления антител к антигенам эритроцитов в антиглобулиновом тесте (реакция Кумбса). В следующих трех пробирках содержится только нейтральный гель, предназначенный для выявления антител к антигенам эритроцитов в солевой среде (холодовых, солевых, или антител, активных в ферментном методе). Тестируемые эритроциты и сыворотка инкубируются при 37 ?С (холодовые -4?С) в микропробирках в геле и затем помещаются в специальную центрифугу. Реакция агглютинации между эритроцитами и антителами определялась визуально: после центрифугирования агглютинированные клетки образуют слой в толще геля (положительная реакция), а неагглютинированные свободно проходят сквозь гель и оседают на дне микропробирки (отрицательная реакция).
С целью выяснения причин гемолиза определяли также свободный гемоглобин в плазме крови [158]. Нормальные значения - 0,01-0,07 г/л. Определение свободного гемоглобина может дать представление о степени гемолиза при различных клинических синдромах, в том числе и при гемолитических процессах. Принцип метода заключается в том, что гемоглобин при взаимодействии с железосинеродистым калием окисляется в метгемоглобин, образующий с ацетонциангидрином окрашенный гемиглобинцианид, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию гемоглобина.
Для изучения изменения проницаемости мембран эритроцитов использовали методы определения осмотической резистентности эритроцитов Лимбека и Рибьера и метод кривой мочевинного гемолиза Колмакова В.Н. и Радченко В.Г.[159].
Осмотическую резистентность э