РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
В ходе выполнения работы было проведено 1190 исследований биологического
материала от 79 больных МДС, ОМЛ-post МДС и ОМЛ de novo. В результате
комплексного обследования все пациенты МДС (48 человек) были разделены согласно
нозологическим формам в соответствии с FAB-классификацией: РА – 12 человек,
РАКС – 1 человек, РАИБ – 13, ХММЛ – 21, РАИБ-т – 1 человек. Верификация
диагноза проводилась на основании общеклинических, морфологических и
гистологических методов исследований. Группу сравнения составляли следующие
нозологические единицы: ОМЛ-post МДС – 11 больных (среди них 3 пациента
исследовались в динамике, начиная от РА до трансформации в ОЛ) и ОМЛ de novo
– 24 больных. Контрольную группу составили практически здоровые лица – 14
человек, у которых не было выявлено никаких форм злокачественных
онкогематологических заболеваний.
Материал для исследований был взят от больных, находящихся на стационарном
лечении в гематологическом отделении №1 (руководитель отделения заболеваний
системы крови ИГТ АМНУ – д-р мед. наук., проф. Третяк Н.Н., зав. отделением –
Зубрицкая Т.Б.) и №2 (зав. отделением – Зинченко В.Н.) КГКБ № 9 Шевченковского
района г. Киева, а также в гематологическом отделении Главного военного
госпиталя МО Украины (зав. отделением – канд. мед. наук Гончаров Я.П.).
Изучаемая группа состояла из пациентов с впервые установленным диагнозом и
больных, поступающих на очередное плановое обследование и лечение с диагнозом,
верифицированным ранее.
Анализ распределения больных МДС, ОМЛ-post МДС и ОМЛ de novo по полу и возрасту
представлены в таблицах 2.1 и 2.2.
Таблица 2.1
Статистические показатели распределения больных МДС согласно FAB?классификации
по полу и возрасту
Стат.
показатели
РА
РАИБ
ХММЛ
МДС, всего
м.
n=7
ж.
n=5
всего
n=12
м.
n=8
ж.
n=5
всего
n=13
м.
n=14
ж.
n=7
всего
n=21
м.
n=29
ж.
n=17
всего
n=46
возраст
М ± m
59,8
3,8
47,0
±
10,9
54,5
5,1
54,3
5,8
66,6
3,6
59,0
4,1
61,6
3,4
68,6
5,4
63,9
2,9
59,1
2,4
61,6
4,4
60,1
2,2
Медиана
58,0
56,0
57,5
58
62
61
61,5
75
64
59
68
61
Диапазон
44-75
19-69
19-75
25-74
60-78
25-78
40-85
45-83
40-85
25-85
19-83
19-85
Больные с ОМЛ соответствовали следующим подвариантам миелоидных лейкемий
согласно FAB-классификации [179, 180]: ОМЛ-М2 - 5 человек, ОМЛ - М4 - 22
пациента и ОМЛ-М5 - 8 человек.
Таблица 2.2
Статистические показатели распределения больных ОМЛ-post МДС и ОМЛ de novo по
полу и возрасту
Стат.
показатели
ОМЛ-post МДС
ОМЛ de novo
ОМЛ, всего
м.
n=5
ж.
n=6
всего
n=11
м.
n=13
ж.
n=11
всего
n=24
м.
n=18
ж.
n=17
всего
n=35
возраст
М ± m
60,4
6,8
56,3
4,3
58,2
3,7
52,1
5,9
58,2
3,3
54,9
3,5
54,4
4,6
57,5
2,5
55,9
2,7
Медиана
65,0
59,5
61,0
54,0
57,0
56,5
58
58
58
Диапазон
35-75
37-66
35-75
24-91
41-78
24-91
24-91
37-78
24-91
2.1. Общий дизайн исследования
Для постановки диагноза и для верификации патологического процесса был
использован комплекс стандартных методов изучения биологического материала в
виде пунктатов КМ, образцов венозной крови, мазков КМ и ПК, который
соответствовал II уровню оказания гематологической помощи больным и включал
следующий набор:
морфологические методы (подсчет лейко- и миелограммы с учетом диспластических
изменений);
цитохимические (постановка и оценка 5 цитохимических реакций в мазках КМ и ПК,
а именно: МП; лизосомальные ферменты - КФ, НЭ; содержание гранул гликогена –
РАS-реакция, а также реакция по Перлсу на наличие сидероцитов и сидеробластов
для верификации диагноза РАКС).
Морфологические и цитохимические исследования проводили на светооптическом
микроскопе Nikon (Япония) с увеличением 100х10.
Специальные методы оценки биологического материала для изучения
патогенетических основ МДС:
метод проточной цитофлюориметрии, с помощью которого анализировали:
а) параметры клеточного цикла (G0/1-, S- и G2/M-фазы) образцов КМ и ПК при
окраске интеркалирующим красителем йодистым пропидием (РI);
б) количество клеток КМ и ПК, находящихся на ранней и поздней стадиях апоптоза
(спонтанный апоптоз in vivo), при помощи двойной метки Аnnexin V – FITC/РI,
согласно методике фирмы-производителя (BD, USA);
в) уровень экспрессии маркеров апоптоза на популяции клеток КМ и ПК миелоидной
и лимфоидной линий дифференцировки: антигена CD95 (FAS/APO-1), отражающего
готовность к реализации апоптотической программы клеток, а также
внутриклеточного протоонкогена Bcl?2, ингибирующего программу апоптоза.
В работе был использован комплекс стандартных и специальных методов, которые
подтверждены соответствующим сертификатом, выданным референтной лабораторией
АМНУ и Всеукраинским государственным научно-производственным центром
стандартизации, метрологии, сертификации и защиты прав потребителей.
Все цитометрические исследования проводили на проточном анализаторе FACScan
(Becton Dickinson, USA) с аргоновым лазером длиной волны 488 нм, с
использованием программы сбора данных LYSYS II (Ver. 1.1). Данный прибор
позволяет считывать 5 измеряемых параметров для каждой клетки: 2 параметра
светорассеяния - прямое светорассеяние (FSC), отражающее размер клетки, и
боковое светорассеяние (SSC), характеризующую внутриклеточную микроструктуру, а
также 3 параметра флюоресценции (в зависимости от применяемых флюорохромов).
2.2. Морфологическое исследование форменных элементов ПК и КМ с
дифференциальным подсчетом лейкоцитарной формулы и миелограммы, качественный и
количественный
- Київ+380960830922