РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Об’єктом дослідження була плазма 35 хворих на вірусні гепатити віком від 17 до
46 років: 20 із них хворі на HBV інфекцію (8 чоловіків та 12 жінок), 15 хворих
на HCV інфекцію (7 чоловіків та 8 жінок) та 15 умовно здорових осіб (8
чоловіків та 7 жінок). Також, отримані під час пологів, материнська і плодова
сироватка крові (породилі віком від 17 до 36 років): у 10 з них вагітність
проходила без ускладнень, у 25 вагітних з була встановлена прееклампсія різного
ступеня тяжкості: легка (8 жінок), середня (8 хворих) і важка (9 жінок).
Використовували антисироватки до імуноглобулінів класу G (НПП “Імунотех”,
Росія) і фібронектину (DАКО, Данія), тест систему для імуноферментного аналізу
(НПП “Імунотех”, Росія).
Кількісне визначення білку в пробах робили відповідно методу Лоурі. В якості
білкового стандарту використовували БСА у відповідному буфері [12]. Етапи і
методи дослідження представлені на рис. 2.1.
2.1. Виділення IgG і імунних комплексів
Виділення імунних комплексів та IgG із плазми або сироватки робили за допомогою
афінної хроматографії з використанням протеїн-A-агарози [131]. Зразки у 0,01М
натрій-фосфатному буфері з pH 7,0 наносили на колонку врівноважену цим же
буфером. Колонку промивали від компонентів, які не зв’язані з протеїн-A, 20-ти
об’ємами буферу. Елюцію IgG та ІК проводили 0,1М трис-гліциновим буфером
pH=3,0, для нейтралізації pH додавали 0,1M NaOH, якій складає 1/6 від
загального об’єму елюату. Профіль елюції показано на рис. 2.2. Фракції із
найбільшою концентрацією IgG, які виявляли за допомогою ракетного
імуноелектрофорезу з використанням моноспецифічної антисироватки до IgG людини,
об’єднували,
Плазма крові
визначення кількості ІК
визначення концентрації IgG
виділення IgG і
імунних комплексів визначення концентрації
фібронектина
дослідження глікозильованності
імуноглобулинів G
розділення імуноглобулінів G
вивчення ступеню деградації
і фібронектину фібронектину
Рис.2.1 Етапи й методи дослідження
діалізували проти 0,01М трис-HCl буфера, pH 7,4 і проводили з ними подальші
дослідження.
Рис. 2.2 Профіль елюції фракцій, що отримані після хроматографії на
протеїн-А-агарозі.
2.2. Визначення кількості імунних комплексів, які циркулюють в кровообігу
Для визначення концентрації імунних комплексів, до 0,2 мл плазми додавали 10%
розчин ПЕГ-6000, виготовлений на 0,1М боратному буфері з рН 8,4 до кінцевої
концентрації розчину ПЕГ 4 %. Після інкубації протягом 18 годин при 4? С і
центрифугували при 20000 g 20 хвилин. До осадку додавали 2 мл 0,1М розчин NaOH.
Через 30-40 хвилин вимірювали концентрацію імунних комплексів на
спектрофотометрі при 280 нм. Для кількісної оцінки використовували
калібрувальний графік на основі термоагрегованих імуноглобулінів G [10].
2.3. Імунотурбодиметричний метод визначення концентрації імуноглобулінів
Антисироватка до імуноглобулінів людини мала у складі ПЕГ. Титр розведення
зразків в 0,9 % NaCl та 4,5 % ПЕГ в 10 мM Na-фосфатного буферу, pH 7,2 для IgA
складав 1/100, для IgG – 1/110, для IgM – 1/100. Інкубували суміш при кімнатній
температурі протягом 5 хвилин. Оптичну щільність визначали при л=340нм,
використовуючи біохімічний аналізатор “Сlinical system, 700”, (Beckman, CША).
2.4. Імуноферментний аналіз
Концентрацію фібронектину плазми (сироватки) або зв’язаного з IgG визначали за
допомогою імуноферментного аналізу (ІФА), який здійснювали на полістиролових
планшетах. В якості контролю використовували стандартний розчин фібронектину з
концентрацією 800 нг/мл в розчинах 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 та фракцію з кількістю
ФН 0 нг/мл. 0,2 мл зразка, що складає 50-800 нг, вносили в лунку і інкубували
протягом години в термостаті. Після кожного етапу незв’язані компоненти змивали
твін-фосфатним буфером. Вносили анти-фібронектинові антитіла і утримували 1
годину при 37? С. Знову на 1 годину при 37? С вносили вторинні антитіла мічені
пероксидазою хрону. Після інкубації з субстратним розчином (0,4 мг/мл
ортофенілендіаміну в 0,1М трис-HCl, pH 7,4, 0,013 H2O2) реакцію зупиняли
додаванням 4М H2SO4 і вимірювали оптичну щільність при довжині хвилі 495нм,
використовували роботозовану лабораторну станцію для ІФА “Biomek, 2000”,
(Beckman, США).
2.5. Отримання фракцій вільних та зв’язаних з фібронектином імуноглобулінів G
Виділення комплексів імуноглобулінів G з фібронектином проводили
шляхом афінної хроматографії на желатин сефарозі (див. рис. 2.3) Фракції ІК
діалізували проти 0,01М трис-HCl буфера, pH 7,4. Вносили в розчин
желатин-сефарози з цим самим буфером. В першій фракції знаходились вільні IgG.
Додавання 1М NaCl призводило до відщеплення з імунних комплексів IgG, які були
зв’язані з фібронектином. Додавання 4М сечовини призводило до розриву зв’язку
між фібронектином та носієм.
2.6. Диск-електрофорез з ДСН
Дослідження глікозильованості IgG проводили шляхом лектин-блот аналізу
HPL-хроматографії. Для лектин-блот аналіза використовували слідуючи методики.
Проводили диск-електрофорез в поліакріламідному гелі з додаванням ДСН, згідно з
модифікацією Леммлі [5]. З ціллю підвищення вміщуючої здібності електрофорезу,
використовували розподіляючий гель з лінійним градієнтом акриламіду з Т=5-17,5
% та перехресною зшивкою С=2%, отриманого шляхом змішування 5 % і 17,5 %
розчинів гелю в градієнтному змішувачі.