РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Більшість експериментів даної роботи було проведено на клітинних лініях,
підтримуваних в культурі. Культура клітин – це метод, який дозволяє зберігати
життєздатність клітини і вирощувати їх поза організмом в поживному середовищі.
Основними перевагами використання культивованих клітин є: можливість їхнього
прижиттєвого спостереження за допомогою мікроскопу; гомогенність популяції
генетично однорідних клітин, що ростуть в постійних умовах; можливість оцінки
росту клітин за короткий період часу; доступність для біохімічних модуляцій;
відсутність етичних проблем, пов’язаних з використанням великих груп тварин.
2.1. Лінії клітин та їхнє вирощування
До роботи було взято наступні лінії клітин: мишачу мієлому X63-Ag8, що є
вихідною клітинною лінією для злиття гібридом; гібридому SP2/0, яка є гібридом
мієломи X63-Ag8 і нормальних В-лімфоцитів миші; гібридому 1D6, яка є гібридом
SP2/0 і нормальних лімфоцитів імунізованої миші, тобто „подвійною гібридомою”,
вона продукує моноклональні антитіла проти позаклітинного фрагменту (181–192)
a3 субодиниці нікотинового ацетилхолінового рецептору щурів; пре-В лімфому
курчат DT40 і лімфому Беркіта людини Ramos.
Гібридому SP-2/0 і мієлому Х63-Ag8 брали з постійних запасів банку клітин
відділу молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна. Гібридому
1D6 було отримано, клоновано і охарактеризовано раніше у відділі молекулярної
імунології Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна [212]. Клітини DT40 і Ramos
були люб’язно надані доктором біологічних наук С.П.Сидоренко (Інститут
експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН
України).
Усі роботи з культурами клітин виконувались в стерильних умовах з використанням
стерильного посуду та розчинів. Посуд стерилізували прожарюванням у сухожаровій
шафі 3 год. при 300°С або автоклавуванням протягом 20 хв. при 121°С і 100кПа в
настольному паровому стерилізаторі «ECOSTERI» («BMT. Brnenska Medicinska
Technika a.s.», Чехія). Розчини стерилізували автоклавуванням або фільтруванням
через стерильну нітроцелюлозну мембрану з діаметром пор 0,22 мкм («Sigma»,
США). Клітини культивували у пластикових флаконах з площею робочої поверхні 25
або 75 см2 («Nunc», Данія) у вологому СО2-інкубаторі при 37°С («Fisher
Scientific Isoterm Incubator», модель 546, США). Культуральне середовище RPMI
1640 («Sigma», США) з додаванням 20 мМ HEPES, 20 мМ L-глютаміну, 5 ґ 10-5М
b-меркаптоетанолу, 50 мкг/мл пірувату натрію, 41 мкг/мл інсуліну, 40 мкг/мл
гентаміцину і 10% ембріональної сироватки теляти («Sigma-Aldrich», США)
поновлювали кожні 2-3 дні. По заповненні клітинами 80% площі флакону, частину з
них знімали і видаляли з пластика легким струшуванням флакону або піпетуванням,
після чого додавали рівний об'єм культурального середовища. Одержану суспензію
клітин центрифугували в стерильних пробірках («Nunc», Данія) на настільній
лабораторній центрифузі (тип T 23 D, Німеччина) за 1000 об/хв протягом 10 хв.
Осад суспендували у культуральному середовищі та підраховували кількість клітин
у камері Горяєва. Життєздатність клітин оцінювали під мікроскопом за включенням
трипанового синього.
Клітини, що вирощували у флаконах, розділяли на прикріплені до підложки і ті,
що знаходилися у суспензії, шляхом механічного струшування. Відрив прилиплих
клітин від дна флакону проводили інтенсивним піпетуванням.
Для підтримання виживання клітин при обертанні в кліностаті середовище
культивування було збагачене сумішшю замінних і незамінних амінокислот
(«Sigma», США).
2.2. Мікроскопічне дослідження клітин
Поверхня дна лунки або флакону дозволяє проводити візуальне дослідження клітин
безпосередньо в мікропланшеті чи флаконі. Крім того, морфологічне дослідження
клітин проводили після фарбування за методом Папенгейма-Крюкова [213]. Для
цього суспензію клітин (1 Ч 107 клітин/мл) осаджували на предметне скло в
цитоцентрифузі і висушували при кімнатній температурі. Спочатку осаджені
клітини обробляли барвником Май-Грюнвальду (10 крапель барвнику протягом 1
хвилини), який фіксував клітини на склі. Після промивання скла дистильованою
водою, фарбували барвником Романовського-Гимзи (15 крапель 10-кратного розчину
протягом 10 хв.), який фарбує клітинні ядра. Зразок сушили і досліджували на
світловому мікроскопі, використовуючи імерсійну рідину.
2.3. Методи оцінки кількості живих клітин
В основу методів визначення життєздатності клітин покладено або забарвлення
мертвих клітин барвником, який не зв’язується з живими клітинами (трипановий
синій), або інкубація з субстратами, які забарвлюються внаслідок включення до
метаболізму живих клітин (тріазоліл блакитний).
Із сухого трипанового синього («Sigma», США) готували розчин: 0,5 г трипанового
синього і 0,9 г NaCl на 100 мл дистильованої води. Розчин змішували з
суспензією клітин у співвідношенні 9:1 і підраховували кількість живих
(незабарвлених) клітин у камері Горяєва [214].
В основу методу включення тріазолілу блакитного покладено здатність живих
клітин метаболізувати 3-[4,5диметилтриазол-2-іл]-2,5-дифенілтетразолію бромід
(МТТ, «Sigma», США [215]) з утворенням кристалів формазану синього кольору
(продукту метаболізму МТТ мітохондріями).
МТТ вносили до культурального середовища у 96-лункові планшети з культурою
клітин до досягнення кінцевої концентрації 0,4 мг/мл. По чотиригодинній
інкубації при 37°С середовище видаляли і кристали формазану, що утворилися,
розчиняли у 100 мкл диметилсульфоксиду протягом 5 хв. за інтенсивного
перемішування на орбітальному шейкері. Після цього до лунок додавали по 25 мкл
0,1 М гліцинового буферу з 0,1 М NaCl, рН 10,5, перемішували
- Київ+380960830922