ГЛАВА 2
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для достижения цели и решения поставленных задач была разработана программа исследований, предусматривающая четыре этапа.
На первом этапе проведен ретроспективный анализ амбулаторных карт женщин перименопаузального возраста.
На втором этапе проведен анализ течения перименопаузального периода, выявлены факторы риска возникновения урогенитальных расстройств и на основании этих данных разработана карта обследования.
Обследование пациенток проведено с применением комплекса методов: изучение анамнестических данных; клинико-лабораторное исследование: осмотр наружных половых органов, осмотр в зеркалах, влагалищное исследование. Так же был сделан общий анализ крови и мочи, проведены бактериологические и бактериоскопические исследования содержимого влагалища, уретры. Проводилось бактериоскопическое исследование мочи по показаниям.
Забор крови у женщин осуществляли однократно в 8 часов утра натощак. В сыворотке крови при помощи иммуноферментного анализа определяли уровни гормонов Е2, прогестерона, фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), пролактина, показатели ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8. Содержание интерлейкинов исследовалось не только в сыворотке, но и в супернатанте 48 часовой культуры клеток крови как без добавления активирующих лейкоциты препаратов, так и с нагрузкой продигиозаном.
Продигиозан - это липополисахарид, который является сильным активатором лейкоцитарных клеток и способен индуцировать синтез и секрецию интерлейкинов. Во многих отечественных и зарубежных работах именно продигиозан используется для определения резервных возможностей лейкоцитов к секреции широкого спектра интерлейкинов. Нагрузочный тест с продигиозаном позволяет выявить способность лейкоцитов к секреции интерлейкинов под воздействием различных факторов. Поэтому если определение концентраций интерлейкинов в сыворотке крови дает представление о цитокиновом статусе обследованного только лишь на момент забора крови, то определение цитокинов в культуре клеток, стимулированных продигиозаном, дает возможность предположить уровень интерлейкинов как до обследования (ретроспективно) так и после (прогностическое значение). Нагрузочный тест с продигиозаном позволяет определить степень активации клеток, участвующих в иммунном ответе (лимфоциты, макрофаги и другие), и выявить потенциальные возможности их к секреции интерлейкинов. Известно, что повышение интерлейкинов в сыворотке крови обозначает системную реакцию иммунитета.
С целью выявления инфекционного процесса проводилось тестирование сыворотки крови на наличие антител класса Ig G и Ig M к цитомегаловирусу (ЦМВ), вирусу простого герпеса (ВПГ) I и II типов, антител класса Ig G и Ig А к хламидиям.
Кроме того, методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) у женщин исследовалась утренняя порция мочи на наличие дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) вышеуказанных инфекционных возбудителей.
Выбор способа забора материала для выявления ДНК хламидий, ЦМВ и ВПГ I, II при помощи ПЦР-анализа осуществлялся исходя из локализации патологии, которая являлась объектом исследования. Так как научно-исследовательская работа предполагала исследование женщин с дизурическими расстройствами, то важно было оценить наличие вышеуказанных возбудителей в уретре и мочевом пузыре. Поэтому материалом для анализа в ПЦР являлся соскоб из передней части уретры и осадок утренней порции мочи. Комбинация этих двух способов позволила максимально полно выявлять инфицирование уретры и мочевого пузыря обследованных женщин.
При проведении исследований использовались коммерческие тест-системы фирм "ROCHE" (Швейцария), "BIO-RAD" (Франция) "Biotech Inc" (США), "GENESIS Diagnostics" (Великобритания).
Морфологическими методами исследованы кусочки ткани уретры, полученные путем пункционной биопсии в 20 наблюдениях у женщин перименопаузального периода с опущением, выпадением внутренних половых органов с наличием и отсутствием дизурических расстройств (по 10 наблюдений в каждой группе). Контролем исследования послужили кусочки ткани уретры женщин без патологии внутренних половых органов, аналогичных возрастных групп, погибших в результате дорожно-транспортных происшествий (секционный материал Донецкого областного судебно-медицинского бюро).
Кусочки ткани, фиксированные в 10 % растворе холодного нейтрального формалина, заливали в парафин по стандартной методике. На ротационном микротоме МПС-2 изготавливали серийные гистологические срезы толщиной 5?1 мкм, которые затем окрашивали гематоксилином и эозином, по Вергоффу, толуидиновым синим при рН 2,6 и 5,3, ставили ШИК-реакцию с обработкой контрольных срезов амилазой.
При выполнении морфометрических исследований руководствовались основными принципами проведения количественных морфологических исследований, изложенными в руководстве Г.Г.Автандилова (1984) [2].
При помощи поляризационной микроскопии проводили оценку морфофункционального состояния стромального компонента и мышечного компонентов уретры.
Рассчитывался индекс степени тяжести расстройств по соотношению удельных объемов поперечнополосатого и гладкомышечного компонента уретры (патент на изобретение № 2001129254) [126].
На третьем этапе разработаны способы профилактики, реабилитации и диспансеризации дизурических расстройств у пациенток с опущением и выпадением внутренних половых органов.
На четвертом этапе внедрены разработанные способы и оценена их эффективность.
Счетная и статистическая обработка результатов проводилась с использованием стандартного пакета прикладных программ Windows'98 фирмы Microsoft на ПК IBM PC/AT486. Вычислены значения средней арифметической (М), среднего квадратического отклонения (?, STD), ошибки определения средней арифметической (m), коэффициента вариации (W), парного (r) и множественного (R) коэффициентов корреляции, определяли уровень достоверности различий (р) сравниваемых групповых средних с помощью t-критерия Стьюдента. Причем, при оценке результатов в динамике лечения