РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Експерементальна частина роботи виконана на любіньському лускатому і безлускому коропах різних вікових груп, двох нових внутріпородних типів, затвердженних Мінагропромом України в 1998 році, які вирощувались у ставах Львівського відділення Інституту рибного господарства УААН, розташованого в с.м.т. В.Любінь, Городоцького району, Львівської області, протягом 2000-2002 років. Біохімічні дослідження проводились у лабораторії росту і розвитку Інституту біології тварин УААН.
З метою дослідження вікових особливостей обміну речовин у скелетних м?язах коропа було проведено дві серії дослідів: (в кінці літнього періоду вирощування і в кінці зимової перетримки).
У першому досліді в дослідженнях були використані зразки скелетних м?язів, одержані з верхньої передньої частини спини любіньського лускатого коропа - цьоголіток, одно -, дво - і трирічок - та любіньського безлуского коропа - одно - і дворічок, одержані від риб наприкінці літнього періоду вирощування (в кінці серпня). Умови вирощування риб відповідали прийнятим у рибництві нормам [ 99]. У годівлі риб використовувалась кормосуміш, яка складалась з пшениці, жита і соняшникової макухи. Вміст протеїну в кормосуміші становив 13-14%. Корм згодовували рибам у зволоженому вигляді, один раз на добу (в 8-900), в кількості 3-5% від маси риби. З метою підвищення природної продуктивності ставів (розвитку біопланктону) їх весною вапнували і вносили гній в кількості 3 т/га.
У скелетних м?язах риб визначали загальний вміст білків і інтенсивність їх синтезу в умовах in vitro, загальний вміст ліпідів, їх жирнокислотний склад, співвідношення окремих класів ліпідів та інтенсивність їх синтезу в умовах in vitro, вміст дієнових кон?югатів, гідроперекисів ліпідів і малонового діальдегіду.
У другому досліді в дослідженнях були використані зразки скелетних м?язів, одержані від риб вказаного віку, за винятком цьоголіток і трирічок у кінці зимової перетримки (в кінці березня). У скелетних м?язах риб досліджували ті самі біохімічні показники і процеси, що і в першому досліді.
Зразки скелетних м?язів коропа одержували через 5-10 хвилин після забою, який проводили шляхом декапітації, обмивали їх охолодженним фізіологічним розчином NaCl і підсушували фільтрувальним папером. Частину скелетних м?язів, в яких визначали вміст білків, вміст ліпідів і їх жирнокислотний склад, а також вміст продуктів перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) заморожували в рідкому азоті і зберігали до початку аналізів. Іншу частину скелетних м?язів, яку використовували для дослідження інтенсивності синтезу білків і ліпідів обмивали охолодженим фізіологічним розчином NaCl, підсушували фільтрувальним папером і відразу використовували в дослідженнях.
2.1. Визначення загального вмісту білків у скелетних м?язах коропа
Загальний вміст білку в скелетних м?язах визначали біуретовим методом [ 74] після екстракції ліпідів. Інтенсивність забарвлення визначали при довжині хвилі 750 нм на спектрофотометрі "Spekol 220" (Німеччина).
2.1.1. Дослідження інтенсивності синтезу білків в скелетних м?язах коропа в умовах in vitro. Інтенсивність синтезу білків в скелетних м?язах коропа досліджували шляхом визначення радіоактивності білків після інкубації зрізів скелетних м?язів з [2-14C]лізином. Зразки скелетних м?язів відокремлювали від сполучної тканини, готували з них зрізи розміром приблизно 1х1х1 мм, переносили їх в інкубаційні посудинки з фосфатним буфером Кребс-Рінгера (відношення маси тканини до об?єму буфера - 1:10, рН - 7.4). Мічений лізин вносили в інкубаційне середовище в кількості 1 мкКюрі. Вмістиме в посудинках інкубували протягом 60 хвилин при температурі 250С в ультратермостаті при постійному перемішуванні (газове середовище - повітря) [ 79]. Утворений в процесі інкубації зрізів тканин СО2 вловлювали 20% водним розчином NaОН і визначали його радіоактивність на рідинному сцинтиляційному лічильнику LKB (Швеція) у толуоловому сцинтиляторі ЖС-8 [ 79]. Після закінчення інкубації ферментативні процеси в інкубаційному середовищі зупиняли шляхом додавання 10% розчину трихлороцтової кислоти [ 17]. Ліпіди із зрізів тканин екстрагували сумішшю хлороформу і метанолу у відношенні 2:1 за методом Фолча [ 37] і визначали їх радіоактивність на вказаному лічильнику. У деліпідованому залишку визначали радіоактивність білків [ 82].
Аналогічні дослідження проводили шляхом інкубації зрізів скелетних м?язів досліджуваних риб з [6-14C]глюкозою, що дозволяло судити про вікові особливості синтезу замінних амінокислот у скелетних м?язах риб і використання їх у синтезі білків.
2.2. Визначення вмісту загальних ліпідів у скелетних м?язах коропа
Зразки скелетних м?язів риб, в яких визначали загальний вміст ліпідів і співвідношення окремих їх класів, розтирали в рідкому азоті. Ліпіди з них ексрагували сумішшю хлороформ-метанол у відношенні 2:1 за методом Фолча [ 155]. Неліпідні домішки з екстракту видаляли шляхом його промивання 0.74 М розчином KCl. Кількість ліпідів у скелетних м?язах риб визначали ваговим методом після відгонки екстракійної суміші [ 85].
2.2.1. Визначення вмісту окремих класів ліпідів у скелетних м?язах коропа. Розділення ліпідів на окремі класи проводили методом висхідної одномірної тонкошарової хроматографії на скляних пластинках, покритих сумішшю силікагелю марок L 5/40 і LS 5/40 "Chemapol" (Чехія). Рухомою фазою служила суміш гексану, диетилового ефіру і льодової оцтової кислоти у відношенні 70:30:1. При цьому виявляли: фосфоліпіди, моно-, ди- і три-ацилгліцероли, неетерифіковані жирні кислоти, вільний і ефірнозв?язаний холестерол [ 104]. Одержані хроматограми проявляли у герметичній камері, насиченій парами йоду. Для ідентифікації окремих класів ліпідів використовували специфічні реагенти і очищенні стандарти. Кількість неполярних ліпідів визначали біхроматним методом [ 176]. Інтенсивність забарвлення визначали на спектрофотометрі "S