РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Відбір тварин для дослідження. Для вивчення дії кадмію хлориду та солянокислого гiдразину на організм тварин використовували білі нелінійні щури-самці трьох вікових періодів: 2,5 - 3-місячні (масою 70-120 г) - період статевого дозрівання, коли спостерігається підвищення чутливості до шкідливих впливів; 6 - 8-місячні (масою 150-220 г) - статеводозрілі; та 18 - 24-місячні (масою 300 г і більше) - старі, в яких процеси катаболізму переважають над процесами анаболізму [179]. Усі тварини утримувалися на стандартному раціоні віварію. В кожну експериментальну групу було включено 5 - 6 тварин. В процесі роботи використано 435 тварин.
Інтоксикацію кадмієм створювали шляхом триразового внутрішньошлункового введення тваринам кадмію хлориду в дозі 3,5 мг/кг (0,04 LD50) маси тіла з інтервалом в одну добу. Токсичне ураження печінки моделювали шляхом одноразового внутрішньочеревного введення, на восьму добу від початку ураження кадмію хлоридом солянокислого гiдразину з розрахунку 90 мг/кг маси тіла [18].
З метою корекції виявлених порушень, через добу після кожного введення кадмію вводили внутрішньошлунково дипептид гліцил-триптофан в дозі 2,0 мг/кг маси тіла (концентрації триптофану і гліцину в крові) та відповідно, гістидин 2,0 мг/кг (концентрація гістидину в крові), міді гістидинат (0,98 мг/кг) і цинку гістидинат (0,34 мг/кг). При цьому виходили з біотичної дози мікроелементів. Металокомплекси синтезовано на кафедрі медичної хімії Тернопільської державної медичної академії з гістидину та гідроксидів металів, які брали в еквімолярних концентраціях. Унітіол вводили через годину після ін'єкції солянокислого гідразину в дозі 100 мг/кг [132].
Для дослідження брали цільну кров, плазму крові, сироватку крові, гомогенат печінки, мікросоми гепатоцитів. Всіх тварин розділили на сім груп: I - iнтактнi, II - уражені хлоридом кадмію та солянокислим гідразином, III - кориговані гістидином, IV - кориговані гістидинатoм міді, V - кориговані гістидинатом цинку, VI - кориговані унітіолом, VII - кориговані гліцил-триптофаном. Декапiтацiю під легким ефiрним наркозом проводили на 1-у, 4-у, 7-у та 10-у доби після введення гідразину. В процесі експерименту проводили спостереження за поведінкою тварин, кольором шерсті, поїданням кормів.
Експерименти на тваринах проводили у відповідності з "Правилами використання лабораторних експериментальних тварин", із збереженням сезонності і часу доби.
2.2. Методи дослідження стану ендогенної інтоксикації та стану мембран
2.2.1. Визначення вмісту молекул середньої маси. Визначення МСМ проводили згідно методики [170], у модифікації [114]. Із сироватки крові виділяли кислоторозчинну фракцію, яку отримували шляхом додавання до 0,2 мл сироватки 1,8 мл 10 % розчину трихлороцтової кислоти. Наступне центрифугування проводили при 3000 об/хв протягом 30 хв. Виділену фракцію в об'ємі 0,5 мл розводили дистильованою водою у співвідношенні 1:10 і визначали оптичну густину при довжині хвилі 254 нм (визначаються ланцюгові амінокислоти) та 280 нм (визначаються ароматичні амінокислоти) проти дистильованої води на спектрофотометрі СФ-46; результати виражали в одиницях, чисельно рівних показникам екстинкції.
2.2.2. Визначення молекул середньої маси у фракціях плазми крові. Окремі фракції МСМ одержували методом гель-хроматографії. Для цього 2 мл плазми фракціонували на колонці із сефадексом G-15 (47х 1,8 см) із швидкістю елюції 44 мл/год 0,02 моль/л оцтовою кислотою. Об'єм однієї фракції складав 3 мл. Оптичну густину визначали при довжині хвилі 254 нм та 280 нм проти дистильованої води на спектрофотометрі СФ-46. Вміст молекул середньої маси у фракціях вражали в умовних одиницях екстинкції [209].
2.2.3. Визначення еритроцитарного індексу інтоксикації. ЕІІ визначали за методом [206]. В основі методу лежать уявлення про еритроцити як універсальний адсорбент, який дозволяє оцінити рівень ЕІ за зміною сорбційної здатності еритроцитів полярного практично не проникного через їхню мембрану метилового синього. В пробірку, яка містила 1 мл 3,8 % розчину натрію цитрату, відбирали 4 мл крові, перемішували і відділяли еритроцити шляхом центрифугування протягом 10 хв. при 3000 об/хв. Плазму видаляли. 1 мл еритроцитарної маси переносили в пробірку, яка містила 3 мл розчину метиленового синього (0,025 %), приготовленого на фізіологічному розчині. Після інкубації протягом 10-12 хв при кімнатній температурі проби знову центрифугували протягом 10 хв при 3000 об/хв. Надосадову рідину (розчину барвника після інкубації з еритроцитами) переносили в кювету спектрофотометра СФ-46 і визначали оптичну густину відносно фізіологічного розчину при довжині хвилі 630 нм. Кількість поглинутого барвника (у відсотках) вираховували за різницею оптичної щільності вихідного розчину барвника та розчину барвника після інкубації з еритроцитами за формулою:
А ( % ) = 100 - Сх100/В, (2.1)
де, А - кількість поглинутого барвника (%);
В - оптична густина вихідного розчину барвника (в од. екстинкції);
С - оптична густина розчину барвника після інкубації з еритроцитами (в од. екстинкції).
2.2.4. Визначення проникності мембран еритроцитів. В основі методу є визначення відсотка гемолізу еритроцитів при різних концентраціях гіпотонічних розчинів натрію хлориду, виготовлених на фосфатному буфері [165].
Еритроцитарну масу, яку одержали шляхом центрифугування 4 мл крові й 1 мл 3,8 % розчину натрію цитрату (протягом 10 хв при 3000 об/хв), тричі промивали буферним розчином із рН = 7,4 (150 ммоль/л натрію хлориду на 10 ммоль/л фосфатному буферному розчині) та ресуспенгували тим ж розчином у співвідношенні 1:4 (еритроцити: буферний розчин). Дослідні розчини містили 3,8 мл гіпотононічного розчину (69 ммоль/л натрію хлориду на 4,9 ммоль/л фосфатному буферному розчині з рН =7,4) і 0,2 мл суспензі