Ви є тут

Механізми участі трансформуючого фактора росту бета у відповіді ракових клітин на дію деяких протипухлинних препаратів

Автор: 
Філяк Оксана Степанівна
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2005
Артикул:
0405U003723
129 грн
Додати в кошик

Вміст

РОЗДІЛ 2
МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

2.1. Об'єкт дослідження

Клітини лінії А549 аденокарциноми легені людини, які використовували у дослідженні, отримані з колекції клітинних культур Інституту цитології РАН (Санкт-Петербург, Російська Федерація). Клітини вирощували у середовищі Ігла модифікованому Дульбекко (ДМЕМ, "Sigma", США) у присутності 10% декомплементованої сироватки крові ембріонів великої рогатої худоби (FCS, "Sigma", США) і 50 мкг/мл гентаміцину ("Sigma", США). Клітини пасажували через кожні дві доби розведенням клітинної суспензії у співвідношенні 1:4.
На певних етапах роботи були використані також клітини інших ліній. Клітини лінії CCL64 епітелію легені норки, використані для біотестування кондиціонованих середовищ на вміст у них ТФР?, отримані із колекції клітин Людвігівського Інституту дослідження раку (Уппсала, Швеція). Клітини лінії НТ1080 фібросаркоми людини (стабільно трансфіковані pGL3-вектором, що містить ген люциферази під CAGA12-промотором та вектором pMC1neoPolyA, що містив ген резистентності до G418) отримані із колекції клітин Людвігівського Інституту дослідження раку (Уппсала, Швеція).

2.2. Визначення проліферативної активності клітин

2.2.1. Визначення цитотоксичної дії досліджуваних речовин. Клітини лінії А549 висівали у 24-лункові пластикові планшети в середовищі ДМЕМ у присутності 10% FCS. Через 24 год додавали досліджувану речовину в різних концентраціях. Підрахунок кількості клітин здійснювали через певні проміжки часу в гемоцитометричній камері Фукса-Розенталя. Густину клітинної суспензії визначали за формулою: с=5000n, де с - кількість клітин в 1 мл суспензії, n - середня кількість клітин в 4-ох великих квадратах камери Фукса-Розенталя.
Відсоток мертвих клітин визначали після їх фарбування 0,1% (w/v) розчином трипанового синього та підрахунку зафарбованих і незафарбованих клітин під світловим мікроскопом.

2.2.2. Включення 3Н-тимідину в ДНК клітин. Вплив ТФР?1 на синтез ДНК в клітинах лінії А549 вивчали за їх здатністю змінювати інтенсивність включення 3Н-тимідину (Amersham Biosciences). З метою синхронізації, клітини витримували 24 год у безсироватковому середовищі ДМЕМ з додаванням BSA (200 мкг/мл). Після цього в лунки додавали FCS до кінцевої концентрації 5% і ТФР?1. Інкубацію проводили при 370С і 100% вологості в атмосфері з 5% СО2 протягом 20 год. Після закінчення інкубації в кожну лунку додавали по 1 мкКі 3Н-тимідину в 1 мл ДМЕМ. Планшети інкубували ще 3 год в аналогічних умовах. Клітини фіксували додаванням холодної 5% трихлороцтової кислоти, двічі промивали холодним розчином PBS (137 мМ NaCl, 2,7 мM KCl, 4,3 мМ Na2HPO4, 1,4 мМ KH2PO4, рН 7,4), після чого промивали 96% етанолом, висушували і розчиняли у 0,1 н NaOH. Отримані проби переносили у флакони, що містили 9 мл сцинтиляційної рідини ЖС-8 ("Монокристалреактив", Україна). Радіоактивність підраховували на ?-сцинтиляційному лічильнику ("LKB", Швеція).

2.2.3. Включення 35S-метіоніну у білки клітин. Вплив протипухлинних препаратів на біосинтез білка у клітинах лінії НТ1080 вивчали за здатністю змінювати інтенсивність включення 35S-метіоніну ("Sigma", США). Клітини інкубували із досліджуваними препаратами та ТФР?1 протягом 4 год, після чого додавали по 20 мкКі 35S-метіоніну у 1 мл середовища та ще інкубували протягом 3 год. Клітини фіксували додаванням холодної 5% трихлороцтової кислоти, двічі промивали холодним розчином PBS, після чого промивали 96% етанолом, висушували і розчиняли у 0,1 н NaOH. Отримані проби переносили у флакони, що містили 9 мл сцинтиляційної рідини ЖС-8 ("Монокристалреактив", Україна). Радіоактивність підраховували на ?-сцинтиляційному лічильнику ("LKB", Швеція).

2.3. Виділення ДНК та її електрофорез у гелі агарози

2.3.1. Виділення апоптичної ДНК. ДНК виділяли з культивованих клітин як описано в [9]. Для цього клітини збирали, двічі промивали охолодженим PBS і осаджували у мікропробірках типу Епендорф центрифугуванням протягом 6 хв при 1500 обертів/хвилину. До осаду додавали лізувальний буфер (20 мМ етилендиамінтетраацетат Na (ЕDTA, "Serva", Німеччина), 50 мМ Тріс-HCl, pH 7,5), який містив 1% NP-40 ("Sigma", США) і обережно ресуспендували протягом 10 сек на льодяній бані. Лізувальний буфер додавали з розрахунку 10 мкл буферу на 106 клітин. Далі проби центрифугували протягом 5 хв при 5000 обертів за хвилину. Надосадову рідину відбирали у чисту пробірку, а осад ще раз ресуспендували у лізувальному буфері і центрифугували протягом 5 хв при 5000 обертів/хвилину. Надосадові рідини об'єднували і до них додавали 10% SDS ("Sigma", США) до кінцевої концентрації 1% та РНКазу А ("Sigma", США), розчинену в буфері ТЕ (20 мМ етилендиамінтетраацетат Na (ЕDTA, "Serva", Німеччина), 50 мМ Тріс-HCl, pH 7,5) до кінцевої концентрації 5 мг/мл, та інкубували 2 год при 560С. Потім додавали протеїназу К ("Sigma", США) до кінцевої концентрації 2,5 мг/мл та інкубували 2 год при 370С. Після інкубації у проби додавали 1/2 об'єму, від загального у пробі, 10 М ацетату амонію ("Sigma", США) і, після перемішування - 2 об'єми (від загального у пробі) охолодженого ізопропанолу. Проби залишали на ніч при -200С. ДНК осаджували центрифугуванням протягом 20 хв при 13000 обертів/хвилину, надосадову рідину видаляли, осад промивали 80% етиловим спиртом та перерозчиняли у буфері ТЕ у розрахунку по 5-10 мкл на 1 млн клітин.

2.3.2. Електрофорез апоптичної ДНК у гелі агарози. Перед розділенням до зразків додавали буфер для нанесення (кінцева концентрація: 7% (w/v) сахароза, 0,04% бромфеноловий синій). Проби вносили у гель із розрахунку 5-6 млн. клітин на лунку. ДНК фракціонували електрофорезом в 1% (w/v) гелі агарози ("Serva", США), використовуючи тріс-ацетатний електродний буфер (буфер ТАЕ: 0,04 М тріс-ацетат, рН 8,0, 0,001 М EDTA). Напруга при електрофорезі становила 5 В/см. Для виявлення ДНК до буферу додавали етидій бромід (кінцева концентрація 2 мкг/мл). Зони ДНК виявляли за їх свіченням в ультрафіолетовому світлі і фотографували