РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дані, представлені в попередньому розділі, свідчать про те, що цілий ряд питань, які стосуються рівня перекисних процесів і антиоксидантної системи захисту в мікроорганізмів рубця великої рогатої худоби з'ясовані недостатньо. Це стосується в першу чергу антиоксидантних ферментів і факторів їх регуляції, зокрема ролі деяких вітамінів і мінеральних сполук в життєдіяльності симбіотичних рубцевих мікроорганізмів.
Виходячи з цього, програмою наших досліджень було передбачено:
- вивчення властивостей деяких ферментів антиоксидантного захисту
(СОД, каталази, глутатіонпероксидази та глутатіонредуктази) у бактерій та інфузорій рубця телят;
- вивчення впливу добавок антиоксидантів (вітамін Е і селеніт натрію) на показники перекисного окислення, антиоксидантного захисту та життєдіяльність бактерій і інфузорій в рубці телят;
- вивчення антиоксидантних властивостей різних макро- і мікроелементів та їх впливу на вказані вище показники.
-вивчення властивостей каталази та впливу на її активність добавок до інкубаційного середовища деяких модуляторів і мікроелементів.
2.1. Характеристика тварин, взяття дослідного матеріалу
Експериментальна частина роботи виконана на бичках-аналогах чорно-рябої породи 6-місячного віку з накладеними на рубець фістулами в дослідному господарстві Інституту біології тварин УААН "Чишки". Тварин годували згідно встановлених норм. У раціон телят обох груп входили сіно лукове, комбікорм, соковиті корми. Комбікорм містив ячмінну - 50%, пшеничну - 25%, горохову - 10% дерть, макуху соняшникову - 14%, мінерально-вітамінний премікс - 1%. Поживна вартість раціону за вмістом протеїну, енергії, мінеральних елементів та вітамінів відповідала віковим потребам телят. Утримання тварин - стійлове.
Накладання фістул на рубець. Перед проведенням хірургічної операції тварини протягом 24-х години витримувались на голодній дієті. Для наркозу використовували 33%-ний етиловий спирт, який підігрівали до температури 38?С і вводили внутрішньовенно в кількості 200 мл на голову. На підготовленому операційному полі (вистригання шерсті, дезинфекція, стерильне полотно) проводили інфільтраційну анастезію 1%-ним розчином новокаїну. Фістулу на рубець тварин накладали в ділянці лівої "голодної" ямки після фіксації тварин на операційному столі в лівосторонньому боковому положенні.
Взяття матеріалу і фракціонування вмісту рубця. Для біохімічних досліджень вміст рубця відбирали через 2 години після ранкової годівлі тварин за допомогою приладу, виготовленого на основі колби Бунзена та вакуумної помпи Комовського, фільтрували його через 4 шари марлі і доставляли у щільно закритому термосі в лабораторію. Одержані зразки вмісту рубця розділяли на окремі фракції (бактерії, інфузорії, кормові частинки, безклітинну рідину) за методом, розробленим А.А.Алиевим і М.Ш.Кафаровим [2]. Для цього фільтрат центрифугували протягом 20-ти хвилин при 2000 обертах за хвилину. Одержаний супернатант розділяли шляхом 20-хвилинного центрифугування при 20000 об/хв на безклітинну рідину (фракція 1) і бактерії (фракція 2). Осад, одержаний після першого центрифугування, розчиняли у фільтраті, додавали калій-фосфатний буфер ( рН 7,0), що містив глюкозу, ацетат натрію і сульфат магнію та інкубували у 250-мілілітровій ділильній воронці при температурі 38оС протягом 60 хвилин. Інфузорії відбирали із нижнього білого шару (фракція 3), а кормові частинки - з верхнього шару (фракція 4). Зразки 2-ої і 3-ої фракцій двічі промивали 0,05М тріс-HC1 буфером (рН 7,2) з наступним центрифугуванням при 20000 об/хв протягом 10-ти хвилин. Одержані в осаді клітини використовували у дослідженнях. Для визначення активності і очищення ферментів осад клітин гомогенізували на ультразвуковому дезінтеграторі УП-1 (Selmi).
2.2. Схема досліджень
Проведено 6 серій досліджень.
Серія 1. Дослідження проведені на трьох бичках 6-місячного віку. Зразки рубцевої рідини переносили в анаеробних умовах в буферну суміш (200 мл/л), яка містила (г/л): K2HPO4 - 5,0, KH2PO4 - 4,0, NaCl - 0,52, MgSO4.7H2O - 0,070, CaCl2 - 0,035, NaHCO3 - 5,9, цистеїн хлориду - 0,174 [194]. Після змішування 50 мл цієї суміші вносили в 120 мл пляшки і додавали в кожну окремо 0,5 або 1,0 мг ?-токоферолу, Na2SeO3 (1 мМ). В окрему пляшку вносили сумісно ?-токоферилацетат 1,0 мг і Na2SeO3, 1 мМ. Джерелом азоту служила сечовина (30 мМ), джерелом енергії - глюкоза (30 мМ). Пляшки закривали корками, продували СО2 та інкубували протягом 24-х годин при температурі 38?С. Контролем служили зразки, в які не додавалися досліджувані сполуки. Після закінчення інкубації відбирали зразки рідини і газу для досліджень. У зразках рідини визначали вміст білка мікроорганізмів, аміаку, загальну кількість летких жирних кислот (ЛЖК) і окремо ацетату, пропіонату і бутирату після хроматографічного розділення та молочну кислоту, а також протеолітичну, целюлолітичну і амілолітичну активності. Фракцію бактерій і інфузорій одержували після диференційного центрифугування визначеного об'єму інкубаційної суміші. У зразках газової фази визначали кількість утвореного СН4.
Серія 2. Дослідження проведені на 3-х бичках 6-місячного віку. Зразки рубцевої рідини обробляли і інкубували так само, як у першому досліді. В інкубаційне середовище додавали 1,0 мг ?-токоферилацетату і 1 мМ Na2SeO3 окремо, а також ?-токоферилацетат ( 1,0 мг) і Na2SeO3 (1 мМ) разом . Контролем служили зразки, в які не додавалися антиоксиданти. У зразках рідини після інкубації визначали вміст гідропероксидів ліпідів (ГПЛ), малонового діальдегіду (МДА), а також активність СОД, каталази, глутатіонпероксидази, глутатіонредуктази і глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Г-6-ФД).
Серія 3. Дослідження проведені на трьох 6-місячних бичках. Зразки рідини рубця перед інкубацією фракціонували і фракції бактерій і інфузорій інкубували як описано попередньо (серія 1). До інкубаційної рідини додавали окремо СаCl2, Na2S, Na2SO4, CrCl3, Na2CrO4, Na2SeO3, ZnCl2,