РАЗДЕЛ 2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Объекты и модели исследования
Основные серии экспериментов были проведены на крысах-самцах линии Wistar массой 160 г. Крыс выращивали и содержали в виварии НИИ биологии Харьковского национального университета им. В.Н. Каразина. В отдельных сериях экспериментов при исследованиях, проводимых in vitro, было использовано 20 кроликов, содержащихся в условиях вивария Ин-та криобиологии и криомедицины НАН Украины.
Экспериментальные крысы были разбиты на 6 групп по 10 животных в каждой группе. Крысы 1-й и 2-й группы получали в течение 50 дней стандартный рацион питания вивария [164,165], дополненный поливитаминной смесью "Ревит" (таблица).
У экспериментальных животных 3-й, 4-й, 5-й и 6-й групп недостаточность рациона по животным белкам и витаминам антиоксидантного ряда моделировали в течение 50 дней путем исключения из диеты поливитаминной добавки "Ревит", провариванием растительного масла (+ 1800 С, 3 часа) [166], а также зерновой смеси и овощей (+ 1000 С, 1 час). Мясную добавку рациона подопытных животных заменяли такой же по количеству добавкой проваренной зерновой смесью (таблица). Крысы 5-й и 6-й групп на фоне несбалансированной диеты после 30 дней эксперимента в течение 20 дней получали дополнительно пищевую добавку муки плодов Aronia melanocarpa в концентрации 0.6 г на одно животное.
Концентрация пищевой добавки аронии черноплодной выбрана на основании данных литературы [167], ранее проведенных в нашей лаборатории исследованиях [168,169] и данных, полученных в настоящей работе об эффективном антиоксидантном и антирадикальном действии аронии черноплодной в условиях in vitro.
Таблица
Суточные количества кормовых продуктов экспериментальных крыс.
Группы животныхВид корма в граммах на одно животноеПшеница (проросшая)
ячмень 3:1Кукуруза (мука)Хлеб (белый)Мясо (вареное)Растительное маслоОвощи
(капуста, морковь 3:1)МелДревесный угольСольAronia melanocarpa
(мука плодов)1,2*12.02.52.03.00.83.00.150.150.10-3,415.02.52.0-0.83.00.150.150.10-5,615.02.52.0-0.83.00.150.150.100.60
Примечание: *- животные 1-й и 2-й группы получали дополнительно поливитаминную смесь "Ревит" (витамины А, В1,В2 и С) 0.005 части драже на 1 крысу в сутки.
Крыс лишали корма за 12-15 часов до забоя. Контрольных и подопытных животных брали в опыт вперемежку, чтобы исключить сезонные влияния.
2.2. Облучение животных и изолированных микросом печени
Облучение подопытных крыс 2-й, 4-й и 6-й групп проводили однократно дозой 8 Гр на установке "Исследователь". Источник ?-облучения 60Со, мощность экспозиционной дозы 1.95 Гр/мин.
Изолированные микросомы облучали однократно дозами 10, 100, 1000 и 10000 Гр на линейном ускорителе электронов "ЛУЭ-6" [170-172]. Энергия электронов при облучении образцов составляла 5 Мэв, средний ток пучка 30 мкА, мощность пучка ускоренных электронов 5.6 Квт, частота посылок от однократной до 50 Гц, плотность потока электронов на объектах с линейными размерами до 15 см до 1012 эл/см2 при неоднородности меньшей 10% (частота следования импульсов 100 за 1сек.)
2.3. Препаративные методы
После декапитации животных печень извлекали, охлаждали в среде выделения, содержащей 0.25 М сахарозу, 1 мМ трилон Б, 10 мМ трис-НCl буфер, рН 7.4. Охлажденную ткань продавливали через пресс и гомогенизировали стекло-тефлон (соотношение навески ткани и объема среды выделения - 1:7). Микросомы печени крыс выделяли методом дифференциального центрифугирования [173] в модификации [174]. Фракцию микросом отмывали в 0.15 М KCl и суспендировали в среде, содержащей 0.125 М KCl, 20 мМ трис-НCl буфер, рН 7.4.
Микросомы печени кроликов выделяли как описано в [175] при 110000 g в течение 60 мин; осадок микросом суспендировали в 40 мМ трис-НCl буфере, содержащем 16 мМ MgCl2, рН 7.4.
2.4. Аналитические методы
2.4.1. Определение NADH-феррицианид (K3[Fe(CN)6]) редуктазной активности. NADH-феррицианид редуктазную активность определяли как описано в [176] в среде, содержащей 100 мкМ NADH, 330 мкМ K3[Fe(CN)6], 1 мМ NaCN, 100 мМ трис-НCl буфер, рН 7.4. Измеряемые скорости восстановления феррицианида регистрировали при 420 нм на двулучевом спектрофотометре Specord UV VIS при постоянном перемешивании и термостатировании при 370С. Активность выражали в нмоль образующегося продукта, используя коэффициент молярной экстинкции, равный 1.02?103 М-1?см-1.
2.4.2. Определение NADH-неотетразолий редуктазной активности. Инкубационная смесь содержала: 50 мкМ NADH, 20 мкМ неотетразолий синий, 1 мкМ NaCN, 100 мМ трис-НCl буфер, рН 7.4. Измерения скорости восстановления неотетразолия синего проводили при 550 нм, как описано в [176]. Активность выражали в нмоль формазина, используя коэффициент молярной экстинкции, равный 28.8 ?103 М-1?см-1.
2.4.3. Определение NADH-2,6-дихлорфенолиндофенол (2,6-ДХФИФ) редуктазной активности. Измерение 2,6-ДХФИФ редуктазной активности проводили как описано в [176] при 600 нм. Активность выражали в нмоль восстановленного 2,6-ДХФИФ, используя коэффициент молярной экстинкции, равный 21 103 М-1?см-1.
2.4.4. Определение содержания цитохромов Р-450 и в5 в микросомах печени. Содержание цитохромов в микросомах определяли методом дифференциальной спектрофотометрии по Omura T. and Sato R. как описано в [176]. Спектры поглощения гемопротеидов записывали на двулучевом регистрирующем спектрофотометре Specord UV VIS. Содержание цитохромов Р-450 и в5 выражали в пмоль на 1 мг белка, используя коэффициенты молярной экстинкции 91 103 М-1?см-1 и 164 103 М-1?см-1 соответственно..
2.4.5. Исследование структурного состояния мембран микросом с помощью флуоресцентных зондов. Струк