РОЗДІЛ 2
ВИБІР НАПРЯМУ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Вибір напряму
Пошуки нових біологічно активних сполук, зокрема антибіотиків, та одержання
більш ефективних препаратів внаслідок модифікації природних молекул є
актуальною фундаментальною проблемою мікробіологічної науки. Більше 60 % із
6000 відомих на сьогоднішній день антибіотиків синтезується стрептоміцетами -
високо диференційованими ґрунтовими грампозитивними бактеріями з міцеліальною
будовою клітин і спороутворенням.
Серед усіх антибіотиків найбільша увага вчених за останнє десятиріччя
зосереджена на біосинтезі полікетидних сполук, яким притаманний широкий спектр
біологічної активності. Сюди відносяться антибактеріальні (тетрацикліни,
макроліди), протиракові (антрацикліни) і протигельмінтні (авермектин)
препарати, а також імунодепресанти (рапаміцин).
Яскравою ілюстрацією пріоритету полікетидів над іншими групами антибіотиків
може бути 8-й Міжнародний симпозіум з генетики промислових мікроорганізмів,
який проходив у Єрусалимі в 1998 р. Із 22 симпозіумів 7 було присвячено різним
питанням продукції полікетидів стрептоміцетами - генетичному контролю
біосинтезу, новим контрольним механізмам експресії генів, метаболітній і
генетичній інженерії одержання гібридних антибіотиків [94]. Підвищений інтерес
вчених до полікетидів можна пояснити кількома причинами - попитом
фармацевтичного ринку лікувальних препаратів на дану групу антибіотиків у
зв'язку з їх широкою біологічною активністю, наявністю промислового виробництва
полікетидів та успіхами науки в розшифруванні молекулярного механізму
біосинтезу цих сполук і розробці експериментальних підходів до створення
гібридних і модифікованих антибіотиків, яких немає в природі.
В Інституті мікробіології і вірусології НАН України одним із традиційних
напрямів наукових досліджень є різні аспекти генетики стрептоміцетів, які
успішно розробляються у відділі генетики мікроорганізмів. Тут вперше було
виділено новий антибіотик ландоміцин Е із родини ангуциклінів, який
продукується культурою Streptomyces globisporus 1912 [12, 13] і має
антибактеріальну і протиракову активність [16]. Показано, що дана культура
успадковує плазмідну ДНК [15] і зроблено попередню спробу рестрикційного
аналізу плазміди [21]. Одержано колекцію ландоміциннедостатніх мутантів з
різними блоками на шляху утворення антибіотика [13], яка представляє науковий
інтерес для дослідження генетичного контролю біосинтезу ландоміцину Е.
Результати згаданих вище досліджень відкривають перспективу для розробки
експериментальних підходів генетичного конструювання високоактивних штамів -
продуцентів ландоміцину Е, а також клонування генів, які кодують біосинтез
даного антибіотика.
Виходячи із реального наукового доробку відділу генетики мікроорганізмів у
вивченні нового протиракового антибіотика ландоміцину Е та наявності колекції
різноманітних мутантів, одержаних від вихідного штаму дикого типу S.
globisporus 1912, вибір напряму досліджень даної дисертаційної роботи -
вивчення явища генетичної трансформації протопластів даного стрептоміцета за
допомогою плазмідної ДНК різного походження - можна вважати закономірним і
логічним продовженням раніше виконаних робіт. Перш за все необхідно було більш
детально дослідити ендогенні плазміди вихідного штама 1912 та їх успадкування
різними похідними мутантами, одержаними за допомогою індукованого мутагенезу,
показати можливість генетичної трансформації протопластів безплазмідних і
плазмідних штамів різного походження і сконструювати на основі ендогенної
плазміди векторні молекули. Відповідно до вибраного напряму роботи були
підібрані матеріали і методи досліджень.
Суть загальної методики проведення досліджень полягала у виділенні очищеної
сумарної плазмідної ДНК із різних штамів стрептоміцетів, її розділенні на
окремі фракції за розмірами і конформаційними станами молекул в агарозному
гелі, екстракції останніх із агарози і їх рестрикційному аналізу. Це дасть
можливість зробити висновок про кількість і розміри ендогенних плазмід у
досліджуваних штамів стрептоміцетів і відібрати безплазмідні мутанти і плазміди
для проведення наступних етапів роботи - трансформації протопластів за
допомогою чужорідних векторів і конструювання векторних молекул на основі
ендогенних плазмід, придатних для генно-інженерних робіт із продуцентом
ландоміцину Е.
2.2. Матеріали і методи досліджень
2.2.1. Штами стрептоміцетів
Таблиця 2.1
Список штамів стрептоміцетів, використаних в роботі
Штам
Синтез ландоміцина Е
Походження
S. globisporus 1912
Низький рівень
Інститут мікробіології і вірусології НАН України (дикий тип, грунт)
S. globisporus 3-1
Високий рівень (300 мг/л)
1912 + нітрозогуанідин
S. globisporus 3-2
Низький рівень
1912, спонтанний варіант
S. globisporus A1
Неактивний
Протопласти 3-1 + нітрозогуанідин + УФ
S. globisporus A2
Неактивний
Протопласти 3-1 + нітрозогуанідин
S. globisporus Б1
Неактивний
Протопласти 3-1 + нітрозогуанідин
S. globisporus Б2
Сліди
Протопласти 3-1 + нітрозогуанідин
S. globisporus RS1
Сліди
1912 + індукція профага
S. levoris 165
Тест на ландоміцин Е
Інститут мікробіології і вірусології НАН України
Streptomyces sp. 8
Носій pDZ8
Інститут мікробіології і вірусології НАН України
S. lividans TK24
Відсутність системи RM
Інститут Джона Іннеса, Англія
Плазміди: pWHM4 (6,6 т.п.н.) [32, 201], pGM160 (7,7 т.п.н.) [147] і pIJ487 (6,2
т.п.н.) [108] одержані від д-ра Г.Крюгеля (Інститут дослідження природних
сполук ім. Ганса Кньоля, Йена, ФРН), pCNB 4001 (17 т.п.н.) - від д-ра Ф.
Мальпартіда (Національний центр біотехнології, Мад
- Київ+380960830922