РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Лабораторні тварини та моделювання експерименту
Експериментальні дослідження проведенні на 650 щурах різного віку та 50 зародках щурів лінії Вістар. Усі тварини утримувалися за стандартних умов віварію ?47?. Дослідження сплановано з урахуванням основних положень моделювання експериментів по вивченню успадкованих радіаційних ефектів у ссавців ?67?. Всі піддослідні тварини, у відповідності до мети та задач дослідження, були розподілені на групи:
- інтактні статевозрілі самці і самки;
- 18-денні зародки, дводенні щурята, самці і самки віком 14, 30, 45, 90, 365 діб, отримані від інтактних щурів;
- статевозрілі самці і самки, опроміненні у сумарній дозі 0,75 Гр;
- статевозрілі самці і самки, опроміненні у сумарній дозі 0,75 Гр, які отримували фармакологічні засоби під час опромінення;
- статевозрілі самці і самки, опроміненні у сумарній дозі 1,0 Гр;
- статевозрілі самці і самки, опроміненні у сумарній дозі 1,0 Гр, які отримували фармакологічні засоби під час опромінення;
- 18-денні зародки, дводенні щурята, самці і самки віком 14, 30, 45, 90, 365 діб, отримані від опромінених у сумарній дозі 0,75 Гр самців і самок;
- 18-денні зародки, дводенні щурята, самці і самки віком 14, 30, 45, 90, 365 діб, отримані від опромінених у сумарній дозі 0,75 Гр самців і самок, які отримували фармакологічні засоби під час опромінення;
- 18-денні зародки, дводенні щурята, самці і самки віком 14, 30, 45, 90, 365 діб, отримані від опромінених у сумарній дозі 1,0 Гр самців і самок;
- 18-денні зародки; дводенні щурята, самці і самки віком 14, 30, 45, 90, 365 діб, отримані від опромінених у сумарній дозі 1,0 Гр самців і самок, які отримували фармакологічні засоби під час опромінення;
Опроміненню піддавали здорових статевозрілих самців і самок віком три місяці та вагою 180-200 г. Для опромінення відбирали самок, які знаходились на одній стадії естрального циклу, останню визначали за допомогою мазків з піхви [85].
Експериментальних тварин піддавали тотальному ?-опроміненню на гаматерапевтичній установці АГАТ-Р № 83 (ізотоп 60Со). Опромінення проводили натщесерце о 9-й годині ранку, за наступних технічних умов: потужність дози 107 рад/хв, відстань від джерела до поля 0,75 м; розміри поля 0,2 ? 0,2 м; одноразово по 0,15 та 0,1 Гр (експозиція у першому випадку вісім, у другому шість секунд) кожні 72 години до досягнення сумарної дози 0,75 та 1,0 Гр відповідно. Дозиметричний контроль проводила дозиметрична служба Обласного онкологічного диспансеру (м. Одеса).
Відповідні групи тварин під час опромінення, з першого по останній день дії радіаційного фактора, включно, отримували біологічно активну харчову добавку з розторопші плямистої (виробник АТ ЗТ УРРТП "Шанс-Драгстор", м. Київ), та глутаргін - (виробник ТОВ "Фармацевтична компанія "Здоров'я", м. Харків).
Біологічно активну харчову добавку з розторопші плямистої додавали до раціону дослідних щурів тричі на день по 0,3 г, сумарна доза на добу складала 0,9 г добавки. При цьому кількість силімарину на добу складала приблизно 80 мг/кг маси тіла. При виборі дози керувалися даними літератури про діапазон фармакологічно активних доз в експериментах по вивченню гепатопротекторних властивостей лікарських засобів [30, 59].
Глутаргін вводили внутрішньочеревно двічі на добу по 1 мл 4 % розчину, що складало 400 мг аргініну глутамату на кг маси тіла на добу. Доза вибрана з урахуванням рекомендацій про визначення равноефектних доз для тварин та людини виходячи з кількості лікарського засобу на поверхню тіла [19, 38].
Вибір зазначених препаратів обумовлений гепатопротекторними властивостями силімарину, а також його антиоксидантними властивостями, здатністю розривати ланцюг вільнорадикального окислення [51]; гепатопротекторними і гіпоамоніємічними властивостями глутаргіну [38], останнє може мате особливе значення враховуючи зміни сечовиноутворювальної функції печінки щурів в гострому і відновлювальному періоді після радіаційного впливу [55].
З метою отримання виводку від радіаційноуражених попередників, на 12-ту добу після завершення дії іонізуючої радіації самців з сумарною дозою опромінення 0,75 та 1,0 Гр відповідно спарювали з самками опроміненими у сумарній дозі 0,75 та 1,0 Гр. Спарювання тварин які не отримували під час опромінення лікарських засобів з щурами які їх отримували не проводили. Відбір самок для запліднення та визначення першого дня вагітності проводили за методиками отримання тварин з точно датованим строком вагітності ?85?. До експерименту брали 18-денних зародків, щурят віком 2, 14, 30, 45, 90, 365 діб, отриманих від інтактних та опромінених самців і самок.
Для визначення особливостей посттрансляційних модифікацій білків хроматину ядер клітин печінки у опромінених тварин, частину статевозрілих самців і самок щурів брали до експерименту на 12-ту добу після завершення дії радіаційного фактору.
2.2. Методи досліджень
Для дослідження реакцій модифікації гістонових і негістонових білків хроматину ядер клітин печінки експериментальним тваринам внутрішньочеревно (із розрахунку на 100 г маси тіла) вводили: 6,0 МБк NaH232PO4 при дослідженні реакцій фосфорилювання та 8,0 МБк 3H-рибози при дослідженні реакцій АДФ-рибозилювання. Через 2 години щурів забивали шляхом швидкої декапітації ?2?. Одразу вилучали печінку, промивали охолодженим до +4 ?С фізіологічним розчином, та готували з неї наважку масою 0,5 г на торзіоних терезах.
Тканини печінки гомогенізували у скляному гомогенізаторі з тефлоновим пестиком за допомогою мікророзмільчувача тканин РТ-2, впродовж 20 хвилини при 1500 обертах на хвилину. Середовище виділення: 5 об'ємів, від наважки, 0,32 М сахарози, яка містила 3 ммоль MgCl2. Отриманий гомогенат фільтрували через подвійний марлевий фільтр. До фільтрату додавали охолоджену деіонізовану воду для зменшення загальної концентрації сахарози до 0,25 моль. Гомогенати розливали до центрифужних пробірок і до кожної додавали чверть від о