ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Модели и объекты исследования.
Опыты были проведены на 145 крысах-самцах линии Вистар (масса = 241 ± 5,81) в
возрасте от 6 до 8 месяцев.
Объектами исследования были сыворотка крови, аорта и поджелудочная железа
животных.
Крысы были получены из вивария НМУ им.А.А.Богомольца. До и во время проведения
эксперимента все животные содержались в одинаковых условиях и на стандартной
диете.
В табл. 1 показано распределение животных на экспериментальные группы.
2.1.1 Моделирование стрептозотоцинового сахарного диабета.
Для моделирования экспериментального сахарного диабета нами был использован
препарат стрептозотоцин в дозе 50 мг/кг (вводимый однократно
интраперитонеально), способный вызывать развитие изменений, патогенетически
близких к инсулинзависимому сахарному диабету [6].
Стрептозотоцин (СТ) (2-дезоксиметил-нитрозомочевина-глюкозопираноза) был открыт
в 1963 году Rakieten et al. в качестве нового антибиотика с широким спектром
антибактериального действия. Однако применение его в условиях клиники вызывало
выраженное побочное действие, которое проявлялось в развитии гипергликемических
состояний. В дальнейшем данный препарат стал использоваться только для
моделирования экспериментального сахарного диабета [1,6,8, 95,144].
Механизмы диабетогенного действия стрептозотоцина [81,95,103,119,120,133].
1. Тропность к бета – клеткам островков Лангерганса.
2. Увеличение процессов NO-индуцированного свободнорадикального окисления.
3. Метилирование ДНК органов – мишеней.
4. Запуск апоптоза или онкоза в бета-клетках островков Лангерганса.
5. Аутоиммунная атака на бета-клетки (ГЗТ, антитело-зависимый цитолиз).
СТ обладает специфическим в-цитотоксическим действием. По мнению ряда авторов,
это связано с нарушением продукции АТФ в митохондриях клеток островков
Лангерганса [6,95]. Нитрозомочевина, входящая в состав СТ, обеспечивает
токсическое действие препарата, а 2-дезоксиглюкоза – его в-цитотропность.
Введение СТ приводит к дозозависимому увеличению продукции перекиси водорода и
активного кислорода, которые не только вовлекаются в процесс развития диабета,
но и играют роль в возникновении осложнений [3,5,13]. Все это сопровождается
образованием разрывов в молекуле ДНК, ее фрагментации, активацией процессов
ядерного поли-АДФ-рибозилирования и снижением уровня внутриклеточного НАД, что,
в свою очередь, приводит к повреждению и гибели в- клеток [151].
В настоящее время основными причинами деструкции в- клеток при развитии СД
являются цитотоксические реакции и апоптоз [81,95,133]. Недостаточно изученной
остается роль гуморального звена иммунитета. При ИЗСД из крови пациентов
выделяют 3 типа циркулирующих антител (антитела к островковым клеткам, антитела
к глутаминовой декарбоксилазе и антитела к антигену 37/40), которые
вырабатываются в ответ на определенные группы антигенов.
Антитела появляются задолго до клинических проявлений диабета и позволяют
проводить его раннюю диагностику [ 47], хотя роль этих антител в развитии СД
остается не до конца выясненной.
Причиной инициации апоптоза при СД может выступать усиление синтеза оксида
азота (NO) и вызванная им повышенная продукция активных кислородных радикалов
[120], действие перфоринов цитотоксических лимфоцитов [103 ] и Fas-FasL
зависимый путь с участием каспазы 3 [ 65,144]. Кроме того, на в- клетках
присутствуют рецепторы фактора некроза опухолей (ФНО-б), которые также вызывают
развитие апоптоза при воздействии на них интерферона альфа (ИФ-б),
секретируемого макрофагами [ 99].
Цитотоксические реакции в панкреатических островках развиваются в результате
инфильтрации их цитотоксическими Т-лимфоцитами, резидентными островковыми
макрофагами, Т-хелперами первого и второго типов [47,72,62,125]. В результате
этого осуществляется инициация аутоиммунного процесса, приводящая в дальнейшем
к уничтожению инсулинсинтезирующих клеток [139]. В ходе первичного поражения
в-клеток высвобождаются их внутриклеточные ферменты и биологически активные
вещества, которые активируют резидентные макрофаги островков и привлекают
моноциты из кровотока [120]. При этом макрофаги, изначально предназначенные для
защитной функции, начинают синтезировать ряд цитокинов, обуславливающих
последующее развитие аутоиммунного инсулита [48]. Основными из этих цитокинов
являются интерлейкин-1 (ИЛ-1), интерлейкин-2 (ИЛ-2), ФНО-б, ФНО-г, которые
оказывают воздействие на в-клетки и окружающую ткань.
ИЛ-1 при взаимодействии со специфическим рецептором (ИЛ-1RtI),
экспрессированным на в-клетках, приводит к подавлению глюкозостимулированной
секреции инсулина и усилению перекисного окисления липидов в митохондриях
в-клеток [48,103]. Данный эффект характерен не только для ИЛ-1, но и ряда
других в-токсических веществ, в том числе и для СТ [97]. Кроме того, ИЛ-1
стимулирует в в-клетках продукцию NO, которая совместно с NO-синтезирующими
макрофагами подавляет синтез инсулина, расширяет капиляры и вызывает активацию
перекисного окисления липидов [ 120,148]. Это приводит к усилению продукции
Fas, что, как указывалось выше, способствует активации механизмов апоптоза в
в-клетках [133]. Кроме того, данные изменения стимулируют экспрессию рецепторов
к ФНО-б (ФНО-R1), что делает в-клетки чувствительными к действию этого
цитокина.
2.1.2. Моделирование аллоксанового сахарного диабета.
Для моделирования данной экспериментальной модели мы использовали препарат
аллоксан, который вводился крысам однократно интраперитонеально в дозе 100
мг/кг массы тела.
В 1943 году Dunn et al. показали, что введение аллоксана (уреида мезоксалевой
кислоты) крысам приводит к пор
- Київ+380960830922