РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1 Лабораторні тварини та моделювання експерименту
Експериментальні дослідження проведені на лінії Вістар. Усі тварини утримувалися за стандартних умов віварію [69]. Дослідження планували враховуючи основні положення моделювання експериментів по вивченню спадкових ефектів у ссавців [88]. У відповідності до мети та задач дослідження експеримент був розподілений на дві частини.
Перша частина заключалася в моделюванні впливу несприятливих факторів оточуючого середовища (радіація в низьких дозах, алкоголь). Для цього було використано 53 самці та 147 самок віком три місяці та вагою 180-200 г. Самок відбирали таким чином, щоб вони знаходились на одній стадії естрального циклу, останню визначали за допомогою мазків з піхви [100].
Експериментальні тварини піддавали тотальному ?-опроміненню на гама терапевтичній установці АГАТ-Р (ізотоп 60Со). Опромінення проводили натщесерце о 9-й годині ранку, за наступних технічних умов: потужність 107 рад/хв, відстань від джерела до поля 0,75 м; поле 20х20 см; одноразова доза 0,1 Гр (експозиція 6 с) кожні 72 години до досягнення сумарної дози 1,0 Гр. Тварин розміщували у спеціально виготовлених клітках-фіксаторах з органічного скла. Дозиметричний контроль проводився дозиметричною службою Одеського онкологічного диспансеру, на базі котрого проводили опромінення.
При виборі методу алкоголізації нами використана методика вільного вибору з використанням 5% водного розчину алкоголю і води ?77?, як одного із найбільш адекватних методів.
Тварин розміщували в індивідуальних клітках 20х30х15, які були оснащенні мірними поїлками з 5% водним розчином спирту та водою, котрі кожний день міняли місцями. Кожний день визначали кількість алкоголю та води які вживалися тваринами. Пристрасть до алкоголю вважали набутою тоді, коли тварини стабільно віддавали перевагу водному розчину алкоголю, і його добове вживання не підпадало різким коливанням. Для виявлення синдрому абстиненції щурів через 2,5 місяці лишали спирту на 7 днів, після чого вони знову мали змогу вільно вибирати між алкоголем та водою. Оцінювали реакції поведінки на протязі деприваційного періоду і кількість алкоголю, що вживався після відновлення алкоголізації.
Відбір самок для запліднення та визначення першого дня вагітності проводили за методиками отримання тварин з точно датованим строком вагітності [69].
Друга частина експерименту була проведена на 106-ти 15-денних ембріонах та 247 щурах-самцях отриманих від опромінених та алкоголізованих перед спарюванням самців та самок. З отриманих нащадків було сформовано для дослідження вісім груп за віковим цензом: І група - 15-денні ембріони; ІІ - 5-денні щурята; III - 2-тижневі щурята; IV - 1-місячні щурі; V - 3-місячні щурі; VI - 6-місячні щурі; VII - 12-місячні щурі; VIII - 24-місячні щурі. Щурів забивали шляхом швидкої декапітації під ефірним наркозом. Вилучали сім'яники, зважували, та заморожували їх в рідкому азоті.
Об'єктом для дослідження були тканини сім'яників.
2.2 Методи досліджень
Для того, щоб отримати уявлення про перекисне окислення, яке відбувається в тканинах живих організмів, доцільно було визначити вміст дієнових кон'югатів (ДК), які з'являються на початкових етапах ПОЛ, та малонового диальдегіду (МДА) - одного з найбільш важливих кінцевих продуктів вказаного процесу. Найважливішим критерієм функціонального стану ферментативної системи антиоксидантного захисту являється активність супероксиддисмутази, каталази, глутатіонпероксидази та глутатіонтрансферази, які забезпечують нейтралізацію активних форм кисню - супероксиданіону та перекису водню, пригнічуючи тим самим процес ліпопероксидації на стадії його ініціації.
Враховуючи те, що в нашому експерименті використовувались сім'яники ембріонів нами були використані мікромодифікації відомих методик [95], що надало можливість у кожної піддослідної тварини комплексно визначити функціональний стан системи ПОЛ-АОС.
Для визначення вмісту дієнових кон'югатів брали 0,2 мл із приготовленого гомогенату тканин сім'яників потім вносили 2 мл суміші гексан-ізопропанол. Герметично закриті пробірки спочатку інтенсивно струшували впродовж 15 хв, а тотім центрифугували при 4000 об/хв. також впродовж 15 хв. Отриманий супернатант виливали до чистих скляних пробірок та додавали 0,5 мл 0,1 N HCl i 1 мл гексану, струшували і залишали на 30 хв. для розшарування фаз. Відібравши верхній гексанмісткий шар вимірювали оптичну густину при довжині хвилі 233 нм в 1 см3 кюветі на спектрофотометрі СФ-46. Розрахунки проводили на основі закону Бугера-Ламберта-Бера [119].
Е233 = ? · с · 1 ; с = Е233 / ? · 1 (2.1)
де ? = 2,20 · 105 - см-1 · М-1 - молярний коефіцієнт оптичної густини для дієнових кон'югатів;
Е233 - оптична густина розчину, що досліджується ;
с - вміст дієнових кон'югатів;
1- довжина оптичного шляху.
Для визначення вмісту малонового диальдегіду до 0,4 мл гомогенату додавали 0,8 дистильованої води; 0,06 мл 5 N HCl і 0,3 мл 17% трихлороцтової кислоти. Проводили центрифугування при 4000 об/хв. на протязі 20 хв. Після центрифугування супернатант виливали до чистих пробірок та додавали 0,5 мл 0,8% тіобарбітурової кислоти. Після перебування на протязі 10 хв при 1000С на водяній бані пробірки переносили до крижаної бані. Вимірювання оптичної густини проводили при довжині хвилі 532 нм в 1 см3 кюветі на спектрофотометрі СФ - 46 проти контролю, до я кого замість гомогенету вносили 0,4 мл дистильованої води. Розрахунки проводили на основі закону Бугера-Ламберта-Бера .
Е532 = ? · с · 1 ; с = Е532 / ? · 1 (2.2)
де ? = 1,56 · 105 - см-1 · М-1 - молярний коефіцієнт оптичної густини для дієнових кон'югатів;
Е532 - оптична густина розчину, що досліджується;
с - вміст дієнових кон'югатів;
1- довжина оптичного шляху.
Для визначення активності супероксиддисмутази [К.Ф.1.15.1.1], до пробірки вносили 60 мг кристалічного однозаміщеного фосфату калію; 0,2 мл гомогенату; 0,03
- Київ+380960830922