РОЗДІЛ 2.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ.
Робота проведена на 992 білих статтєвозрілих щурах лінії Вістар, масою 160,0-210,0 грам, що містилися на стандартному харчовому раціоні віварію.
Для досягнення поставленої мети проводилися слідуючі дослідження: визначення впливу пірацетаму та вивчаємих нейропептидів на показники відтворення енграм розлогової пам'яті, встановлення на фоні застосування пірацетама, АВП, його аналогів, а також С- і N-кінцевих фрагментів гормона, змін біоелектричної активності і ряда нейрохімічних показників функціонального стану гіпокампа.
Процеси відтворення енграм прострової (розлогової) пам`яті (ПП) вивчали у водному лабірінті Морріса [213].
Платформа являла собою чорну пластину з радіусом 5,5 см, яка була розташована на 1 см нижче поверхні води, що заповнювала чорний басейн (діаметром 1,5 м, з температурою води 22 градусів С.) На стіни басейну під кутом 90 градусів, відповідно сторонам світу, були нанесені геометричні фігури, що давали щурам змогу орієнтуватися у просторі лабірінту. Навчання щурів проводилося протягом 2 днів та включало 4 сесії по 4 спроби досягнення платформи, в цих умовах тварина стартувала щоразу із різних квадратів басейну в послідовності, яку обрали довільно. Щурам, які знайшли платформу, дозволяли залишатися на ній в перебігу 30 секунд. Після чого починалася наступна процедура навчання.
Якщо в перебігу першого блоку навчання тварині не вдавалося знайти платформу напротязі 60 секунд, вона виключалася з експерименту.
Час, за який тварина знаходила занурену у воду платформу, реєстрували як латентний період умовної реакції. Даний показник реєструвався в кожній пробі тварин і являв собою результуючий показник для кожного блоку навчання.
Для перевірки вироблення плавального тесту на 3 день платформу видаляли з басейну. Кожного щура містили в басейн напроти квадрату, де платформа була напротязі перших днів навчання. Після плавання на протязі 60 секунд щур повертався до своєї клітки і час, який щур знаходився в кожному з чотирьох квадратів, розцінювався як придбана просторова пам'ять.
Для дослідження біоелектричної активності вивчаємих структур щурам у гострих експериментах під тіопенталовим наркозом (50 мг/кг) за допомогою стереотаксичної техніки вводили сталеві електроди.Для дослідження змін біопотенціалів гіпокампа електроди вводилися білатерально по слідуючим координатам : АР - 3,6 мм від лінії Брегма, на + 2,5 мм від середньої лінії, DV- 3,0 мм нижче поверхні черепа, на глибину 2,4 мм. Два коаксиальних електроди накладали на фронтальну зону кори головного мозку [214,215] .
Оцінка функціонального стану гіпокампа у співствленні з фронтальною зоною неокортексу, включала вимір їх біоелектричної активності по частоті та амплітуді реєструємих потенціалів. Одночасно визначали сумарну біоелектричну активність гіпокампа і фронтальної зони неокортекса шляхом її цифрової фільтрації. В ході її біопотенціали розподілялися на 4 основних частотних піддіапазону, ( бета-, альфа-, тета- і дельта-) в межах, кожного з яких визначали спектри потужності, частотну та амплітудну характеристики біопотенціалів. Перевага цифрової фільтрації полягає в тому, що її використання сприяє поділу широкополосної сумарної біоелектричної активності на більш вузькі ідентифікаційні фрагменти, що дозволяє усунути "інформаційний шум" і додати досліджуємим параметрам більшу вірогідність [216].
Потенціали, що відводились від проекційних зон вивчаємих мозкових утворень, подавалися на вхід многоканального підсилювача, далі на аналоговий фільтр аналізатора, де вони поділялись на частотні піддіапазони. Вихідні сигнали аналогового фільтра, а також сумарна біоелектрична активність перетворювалися в цифрову форму та надходили в комп`ютер (клас IBM - 486), із вбудованим програмним модулем (тип МВ - 5202), що розподіляв та аналізував отриману інформацію по рядах Фур'є, обчислювалися спектри потужності, визначалися амплітудні і частотні характеристики. Зміни реєструємих показників визначали через 5, 10, 15, 20, 30 , 45 і 60 хвилин після внутрішньочревної ін`єкції ксенобіотиків.
Про перебіг біохімічних процесів в гіпокампі на фоні дії досліджуємих речовин свідчили вміст вільних жирних кислот (ВЖК), концентрацію проміжних продуктів різних шляхів біологічного окислення субстратів - малонового діальдегіда (МлД), молочної кислоти (МК), а також 2,3 - діфосфогліцеринової кислоти (2,3 - ДФГ).
Для визначення складу вільних жирних кислот із тканини гіпокампа щурів екстрагували загальні ліпіди за методом Фолча [217]. Після метилювання жирних кислот газовохроматографічний аналіз проводився на хроматографі "Schimadzu - 9 A" з полум'яно-іонізаційною детекцією при температурі стовпчика 180 градусів С, в якості твердофазного носія використовували "Хроматон NAW" (Англія), насичений 15% розчином полиетиленгліколя сукцинату, а газа-носія - гелій. Для ідентифікації піків використовувалися, як стандарти, метилові ефіри відповідних жирних кислот.
Концентрацію молочної кислоти визначали після фіксації тканини мозку рідким азотом за методом Хохорста. Методика заснована на вимірі при довжині хвилі 340 нм, вмісту відновленої форми НАД, у зразку, яка утворюється при окисленні молочної кислоти лактатдегідрогеназою. Продукт цією реакції - піровиноградна кислота зв'язується гліцингідразиновим буфером, що сприяє повному окислюванню лактата [218]. Концентрацію МК обчислювали в міллімолях на грам тканини.
Зміст малонового діальдегіда встановлювали по реакції з тіобарбітуратовою кислотою [219]. В основі методу лежить здатність МлД при високій температурі в кислому середовищі утворювати з 2-тіобарбітуратовою кислотою пофарбований триметиновий комплекс з максимумом поглинання світла при довжині хвилі 532 нм. Рівень проміжного продукту вимірюв
- Київ+380960830922