ГЛАВА 2
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объекты исследования
Эксперименты по доклиническому изучению влияния противотуберкулезных препаратов на иммунитет животных проводили на крысах и морских свинках.
В опыте использованы 320 половозрелых морских свинок обоего пола массой 280-305 г и 360 крыс линии (WAG Wistar albina glaxo) массой 180-200 г. Во время эксперимента животные содержались в стандартных условиях вивария согласно принятых санитарно-гигиенических условий. Работа с животными проводилась в соответствии с принципами Европейской конвенции по защите лабораторных животных согласно норм GLP. В работе приведены соответствующие протоколы комиссии по биоэтике относительно использования лабораторных животных в эксперименте.
До проведения экспериментов всем животным была проведена проба Манту для исключения у них эндогенного заражения. С целью развития туберкулеза было проведено внутривенное заражение путем введения в хвостовую вену 0,01 мл суспензии культуры лабораторного штамма H37Rv.
В опыте животных делили на 8 групп: I группа - интактные животные (контроль); II группа - нелеченные животные с экспериментальным туберкулезом (для вирификации штамма было проведено микробиологические исследования, подтвердившие наличие у животных лабораторного штамма H37Rv); III группа - зараженные животные, получавшие сочетанное лечение рифабутином; IV группа - зараженные животные, получавшие лечение канамицином; V группа - зараженные животные, получавшие сочетанное лечение рифампицином; VI группа - зараженные животные, получавшие сочетанное лечение офлоксацином; VIІ группа - зараженные животные, получавшие сочетанное лечение изониазидом, рифабутином и офлоксацином; VІIІ группа - зараженные животные, получавшие сочетанное лечение изониазидом, рифампицином и канамицином. В каждой группе было по 10 крыс или по 8 морских свинок.
Лечение начинали на седьмой день после заражения и проводили 30 дней. Рифабутин вводили per os из расчета 10 мг/кг веса животных; рифампицин - в дозе 10 мг/кг; офлоксацин - 10 мг/кг; изониазид - 10 мг/кг и канамицин - 30 мг/кг. После окончания опыта выжившие животные забивались в условиях эвтаназии. Проводили исследования крови, ткани селезенки и легких исследуемых животных. У животных определяли массу легких и индекс поражения легких по 4-х бальной системе (от единичных слабовыраженных очагов - 1 балл до множественных крупных некротических очагов - 4 балла).
В клинической части исследования в соответствии с поставленными задачами было обследовано 60 больных инфильтративной формой туберкулеза легких в возрасте от 18 до 59 лет, находящихся на стационарном лечении в клинике НИИ легочных заболеваний за период 2002-2005г. Среди обследованных преобладали мужчины - 45 (75%), женщин было - 15 (25%). Контрольную группу составили 20 практически здоровых лиц однородных по полу и возрасту с больными ТБ легких исследуемых групп.
2.2. Методы исследования
Оценку состояния системы неспецифической резистентности и иммунного ответа животных проводили при помощи определения фагоцитарной активности лейкоцитов по унифицированной методике методом инкубации культуры клеток с частицами латекса; методу оценки образования активных форм кислорода фагоцитами (метод спонтанной и индуцированной зимозаном люминолзависимой хемилюминесценции); методу восстановления тетразолия нитросинего (НСТ-тесту); методикам определения Е-, ЕАС-, авторозеткообразующих клеток и определения гемолитической активности сыворотки; методу определения концентрации ЦИК. Помимо этого, в работе проводили изучение морфологии клеток, миелограм и лейкограм крови, определение гемоглобина и показателя СОЭ.
Для больных туберкулезом людей использовали результаты обследования традиционными клинико-рентгено-лабораторными методами, а также проводили изучение системы неспецифической резистентности и иммунного ответа. При исследовании клеточного и гуморального иммунитета, а так же параметров неспецифической резистентности использовали методы, анологичные методам доклинических исследований, а так же дополнительные методики.
Активационную и пролиферативную способность лимфоцитов оценивали по адаптированной методике Павлюка А.С. Фагоцитарную активность нейтрофилов определяли в тесте восстановления нитросинего тетрозолия (НСТ-тест). По методике М.Л. Биленького проводили исследование люминолзависимой хемилюминесценции фагоцитирующих клеток (ЛЗХЛ).
Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови (CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD19+, CD21+, CD25+, CD69+) определяли по методу проточной цитофлюориметрии. Экспрессию поверхностных маркеров Т-лимфоцитов определяли по стандартной методике иммунофенотипирования с использованием венозной периферической крови, взятой из локтевой вены и смешанной с гепарином (25 ЕД/мл).
Метод определения показателей периферической крови. Гемоглобин, СОЭ и лейкоцитарную формулу изучали по общепринятым методикам клинического анализа крови.
Изучение морфологии клеток, миелограм и лейкограм крови проводили в мазках, изготовленных из суспензий клеток и окрашенных азур-ІІ-эозином по Романовскому-Гимзе. В каждом мазке изучали 300 клеток.
Для подсчета клеток крови общепринятым методом использовали гемоцитометр (камеру Горяева). Для подсчета ядросодержащих клеток применяли 2 % раствор уксусной кислоты.
Метод определения фагоцитирующей активности гранулоцитарных нейтрофилов. Фагоцитарную активность лейкоцитов определяли по следующей методике. В видалевскую пробирку наливали 0,1 мл 2% лимоннокислого натрия, 0,2 мл исследуемой крови и 0,1 мл взвеси тест-микроба (штамма стафилококка № 209, взвесь которого готовили из суточной агаровой культуры по стандарту и разводили до 400 млн микробных тел в 1 мл). Все компоненты тщательно смешивали и пробирку помещали на 30 мин в термостат при 37°С. после инкубации ее центрифугировали в течение 3 минут при 1000 оборотах в минуту. Затем из верхнего слоя осадка готовили мазки, которые фик