РАЗДЕЛ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Соединения и реактивы, использованные в исследовательской работе
Исследование процессов модуляции комплекса ГАМК-рк, фармакокинетики и фармакодинамики экзогенных лигандов ГАМК - медиаторной системы проводилось с использованием агонистов - производных 1,4-бенздиазепина, их метаболитов, а также их радиоактивных аналогов (14С-феназепама (1 Сu/mol), 14С-циназепама (0,3 Cu/mol), 14С-3-оксифеназепам (0,5 Cu/mol)), синтезированных в ПНИЛ-5 Одесского национального университета им. И. И. Мечникова и в Физико-химическом институте им. А.В. Богатского НАН Украины; 14С-этанола (1,3 Cu/mol) (ВТО "Изотоп"), мусцимола (фирма "Sigma"), оксибутирата натрия (ГОМК) ("Реахим"); антагонистов бенздиазепинового рецептора - производных имидазобенздиазепина (Ro 15 17-88), синтезированных в ПНИЛ-5 ОНУ; обратных агонистов: бикукуллина ("Sigma"), коразола, тиосемикарбазида ("Реахим").
В ходе научно-исследовательских работ использовались: твин - 40 и 20, тритон Х-100 фирмы "Serva" (ФРГ), 2,5-дифенилоксазол (ПОПОП), 1,4-бис-2-(5-фенил) оксазолилбензол (ППО). Остальные реактивы (органические растворители, кислоты, щелочи и др.) производства фирмы "Chemapol" (ЧССР) и отечественного производства марки ч.д.а. и о.с.ч.
2.2. Подготовка животных к эксперименту
Эксперименты были проведены на мышах линии СВА, С57BL/6, гибридах F1 (CBA x C57BL/6), BALB/c. Экспериментальные животные были получены из питомника "Столбовая" (Москва, Россия) и содержались на полноценной лабораторной диете при естественном световом цикле. Исследуемые водорастворимые соединения вводили в изотоническом растворе NaCl, липофильные - в твиновой суспензии. Были использованы внутрибрюшинный, внутривенный и интрагастральный способы введения веществ экспериментальным животным. Контрольным животным вводились соответствующие объемы физиологического раствора и твиновой суспензии.
2.3. Определение порогов чувствительности к обратным агонистам ГАМК - рецепторного комплекса (метод внутривенной инфузии)
В качестве количественного показателя изменения функций медиаторных систем in vivo предложен [80] метод регистрации пороговых доз обратных агонистов (минимальные эффективные дозы - МЕД (мг/кг)) при их внутривенной инфузии с постоянной скоростью, вызывающие различные компоненты судорожного припадка - клонико-тонические судороги (ДКТС), тоническую экстензию (ДТЭ). Противосудорожные вещества вводились различными способами в конкретные промежутки времени до введения судорожных соединений. Оценка показателей эффекта проводилась в количественной форме (градуированная форма учета) [103,104].
2.4. Регистрация противосудорожного действия лигандов и одновременное определение содержания 14С- продуктов в головном мозгу мышей
Исследование противосудорожной активности у мышей линий C57BL/6, BALB/c, CBA и нелинейных проводили путем регистрации минимальных эффективных доз коразола (МЭД) (1%) и бикукуллина (0,01%), вызывающих клонико-тонические судороги (ДКТС) и тоническую экстензию (ДТЭ) в контрольной группе животных и на фоне введения 14С-феназепама, циназепама и 14С-3-оксифеназепама в различных дозах. Коразол и бикукулин вводили внутривенно в хвостовую вену с постоянной скоростью. Одновременно проводили определение содержания радиоактивных продуктов в головном мозгу мышей. Непосредственно после регистрации судорожного действия коразола животных декапитировали, извлекали головной мозг и определяли общую радиоактивность. С этой целью навески мозга мышей гомогенизировали и по 0,3 мл растворяли в толуол-спиртовом сцинтилляторе. Определение проводили на сцинтилляционном счетчике "Cambera-Pakkard" (США).
2.5. Оценка эффектов мусцимола, этанола и флумазенила
Опыты проведены на нелинейных мышах-самках, массой 18-22 г. Мусцимол (6 и 3 мг/кг) вводили внутрибрюшинно, этанол в дозах 3, 6 и 8 г/кг за 30 мин до внутрибрюшинного введения тиосемикарбазида (6-25 мг/кг) и регистрировали вероятность развития клонико-тонических судорог (КТС) и тонической экстензии (ТЭ).
Для оценки противосудорожного действия экзогенных лигандов данной медиаторной системы было изучено изменение МЭД коразола, вызывающих клонико-тонические судороги (ДКТС) и тоническую экстензию (ДТЭ) на фоне внутрибрюшинного введения мышам Ro 15-1788 и его нитропроизводного и их совместном введении с феназепамом. Нитропроизводное флюмазенила вводили внутрибрюшинно в дозе 250 мг/кг за 60 мин до внутривенного титрования коразолом. Феназепам вводили внутрибрюшинно в дозе 2,8 мг/кг через 30 мин после введения вышесказанных соединений и определяли МЭД, вызывающих клонико-тонические судороги и тоническую экстензию. Противосудорожная активность феназепама и этанола оценивалась в зависимости от возрастающих доз Ro 15-1788 (50-150 мг/кг) при введении феназепама в возрастающих дозах (0,175-2,8 мг/кг) и этанола в дозе 2г/кг и от возрастающих доз этанола (1-3 г/кг) при введении Ro 15-1788 в дозе 100 мг/кг.
2.6. Экспериментальные модели изучения фармакодинамики и фармакокинетики лигандов ГАМКА- рецепторного комплекса
2.6.1. Определение параметров фармакокинетики феназепама у мышей различных линий
Опыты были проведены на мышах самцах линии СВА, C57BL/6, F1. 14С-феназепам вводили внутрибрюшинно в твиновой эмульсии в дозе 14 мг/кг. Животных декапитировали через 0,5; 1; 2; 3 и 6 ч после введения препарата. Определяли содержание исходного соединения и 3-оксипроизводного в плазме крови, мозге и печени мышей. Разделение феназепама и его метаболитов проводили методом зонной радиохроматографии [105,106]. Хлороформные экстракты гомогенатов органов и тканей экспериментальных животных наносили в виде линии 1,5-2,5 мм на 5 см выше нижнего края пластинки "Силуфол -УФ-254". Для отделения коэкстрактивных веществ хроматография проводилась в четыреххлористом углероде в направлении к нижнему краю пластинки. В этом случае исследуемые соединения остаются на стартовой линии, а коэкстрактивные вещества мигрируют. Часть пластинки на 1 см ниже стартовой линии отрезают и хроматографируют в
- Київ+380960830922