РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Обоснование используемых дозировок изучаемых соединений, выбор структуры эксперимента и объектов исследования
Выбор дозировок изучаемых соединений проводился с учетом изученной ранее острой и хронической токсичности и доз, используемых для изучения фармакодинамики координационных соединений германия с биолигандами [5, 6, 205, 234]. Согласно проведенным фармакодинамическим исследованиям, нейротропное действие соединения оказывали в дозах 1/10, 1/40, 1/80 и 1/135 ЛД50. Действие БАВ на морфо-функциональное состояние печени животных изучалось на 4-х различных дозировках: 1/10, 1/20, 1/40 ЛД50 и средне терапевтических 1/135 ЛД50. В связи с этим дозы препаратов были следующими:
ПрепаратДоза (мг/кг)1/10 ЛД501/40 ЛД501/80 ЛД501/135 ЛД50МИГУ-1
МИГУ-2
МИГУ-3 147
210
290 37
53
72 18
26
36 11
16
21
Для проведения фармакокинетических исследований по германию, в сопоставимых условиях, концентрации изучаемых комплексов выбирали таким образом, чтобы обеспечить оптимальные концентрации германия в тканях животных для последующего его фотометрического определения. При этом учитывали низкую токсичность изучаемых соединений, а также широкий концентрационный интервал их применения при исследовании фармакодинамики на моделях различных патологий (1/10 - 1/135 ЛД50) [5, 6].
Средине калибровочной кривой соответствовало содержание германия 37,5 мг/кг животного. Исходя из этого, рассчитывали вводимое количество изучаемых соединений. Другими словами, в каждом из изучаемых БАВ доза германия была одинаковой - 37,5 мг/кг, что дало возможность сравнить полученные результаты. Таким образом, изучение фармакокинетики МИГУ-1, -2, -3 проводилось по германию, входящему в их состав.
Выбранная расчетная доза составила 1/4 ЛД50 МИГУ-1 (361 мг/кг), 1/6 ЛД50 МИГУ-2 (368 мг/кг), 1/16 ЛД50 МИГУ-3 (186 мг/кг). Исследования проводились на крысах самцах линии "Вистар" примерно одной массы - 140-160 г. Условия содержания животных во время эксперимента, продолжительность наблюдения и число их в группе определялось требованиями, изложенными в документе "Требования к испытаниям на безопасность новых медицинских продуктов", действующего в пределах Европейского экономического сообщества, а также методическими рекомендациями фармакологического комитета МОЗ Украины [242-244].
Все вещества вводились однократно внутрибрюшинно. Соединения МИГУ-1 и МИГУ-2 плохо растворимы в воде, поэтому их вводили в суспензии. Для предотвращения седиментации, суспензию соединений МИГУ-1 и МИГУ-2 на 10 % растворе твина готовили непосредственно перед введением. Навеску соединения рассчитывали, исходя из общей массы группы животных, а индивидуальные дозы рассчитывали по объему вводимой суспензии в зависимости от массы тела животного. МИГУ-3 вводили в растворе, дозу рассчитывали аналогично.
Изучение фармакокинетики координационных соединений с биолигандами проводилось на 343 крысах. Интервалы времени эксперимента выбирали согласно положениям, изложенным в документе, одобренном Фармакологическим Комитетом МЗ Украины, "Методические рекомендации к изучению фармакокинетики" [243, 244]. Выбраны следующие интервалы времени: 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 8 час; то есть возрастающие в геометрической прогрессии с периодом равным 2, заключительным интервалом выбрано время 24 час. В период наиболее медленного снижения концентрации вещества выбрано 3 пробы биоматериала. Через указанные интервалы времени животных, после усыпления, декапитировали по методу, предусмотренному международными правилами [242].
Наряду с изучением изменения концентрации вещества в плазме крови, исследовалось его распределение в тканях. Выбор тканей осуществлялся с учетом их васкуляризации. В качестве сильно васкуляризированных тканей использовали сердце, селезенку, легкие; умеренно - мышечную ткань; слабо - жировую ткань. Для изучения распределения данных БАВ в органах, обеспечивающих элиминацию, исследовали пробы печени и почек. Фармакокинетику соединений также изучали в зоне действия - головной мозг и печень [8-10, 243, 244].
Для изучения использовали навески по 500 мг проб сердца, селезенки, легких, мышечной и жировой тканей, печени, почек и головного мозга. Навески взвешивали на торсионных весах ВТ - 500, а реактивы - на аналитических весах WA - 21. Пробы печени, жировой и мышечной тканей отбирали из одних и тех же участков. Для удаления остатков крови пробы тканей тщательно промывали дистиллированной водой до получения прозрачной жидкости и отжимали между листами фильтровальной бумаги. Цельную кровь и плазму отбирали в количестве 1 мл. В семи интервалах времени статистические группы наблюдения составляли по 9 животных. Для изучения фармакокинетики одного соединения использовали 83 крысы (830 проб), для изучения трех соединений - 249 крыс (2490 проб). Оптимизация методов извлечения и определения германия проводилась на 67 крысах.
Экскреция каждого соединения в одном интервале времени изучалась на 9 крысах (всего 27). После однократного внутрибрюшинного введения соединений крыс содержали в обменных клетках. Мочу и фекалии собирали в течение пяти суток в одно и то же время, согласно методическим рекомендациям [8, 244]. Определяли общий объем мочи, часть использовали для исследования. Германий определяли по описанной ниже методике.
2.2. Фармакокинетические методы исследования
Изучение фармакокинетики координационных соединений германия с биолигандами (никотиновой кислотой - МИГУ-1, никотинамидом - МИГУ-2 и янтарной кислотой - МИГУ-3) проводилось по иону-комплексообразователю - германию. Cодержание германия в тканях определяли спектрофотометрическим методом с использованием фенилфлуорона [245].
Определение микроколичеств германия в тканях животных достаточно сложно. Так, при сухом озолении вводимые микроколичества германия обнаружить не удавалось. Это