РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Умови проведення дослідів
Експериментальні дослідження проводились на базі проблемної лабораторії кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології НАУ, Центральної державної лабораторії ветеринарної медицини Міністерства АП України та в Київському науково-дослідному інституті епідеміології та інфекційних захворювань ім. Л.В. Громашевского Міністерства охорони здоров'я України.
Для дослідження були використані перераховані нижче матеріали.
1. Штами вірусу сказу:
- референс-штам СVS, вірулентний для білих мишей, кролів, морських свинок, хом'яків при введенні у мозок;
- вакцинний штам "Овечий" (ВГНКІ), вірулентний для овець,
кролів, морських свинок та мишей при введенні у мозок;
- вакцинний штам "Щелково-51 К", адаптований до КК ВНК-21, вірулентний для овець, кролів, морських свинок та мишей при введенні у мозок;
- вакцинний штам "Внуково- 32", адаптований до первинної культури клітин нирки дитинчати сірійського хом'яка.
Штами вірусу сказу зберігали у вигляді замороженої (-40 оС) вірусмісткої суспензії. Штами "CVS" та "Овечий" (ВГНКІ) підтримувались в лабораторних умовах шляхом періодичного пасажування (двічі на рік) на білих мишах, штам "Щелково-51 К" - на вівцях.
2. Клітинні культури :
- перещеплювана лінія клітинної культури НГУК-1 (невринома Гассерова вузла щура), отримана з Казанського ВНДІ (Російська Федерація);
- перещеплювана лінія клітинної культури ВНК-21/17 (нирка дитинчати сірійського хом'яка, клон 17); отримана з Херсонської біофабрики.
3. Живильні середовища: DMEM, гідролізат лактальбуміну, середовище 199, середовище RPMI 164.
4. Лабораторні тварини:
- кролі породи шиншила, масою тіла 1,5 - 2,0 кг - 38 гол;
- білі миші безпородні, масою тіла 9-12 гр - 3000 гол;
- вівці віком 8 - 12 місяців, масою тіла 50 кг - 2 гол.
5. Сироватки крові:
- сироватка крові великої рогатої худоби не консервована, для використання клітинних культур, виробництва Конотопського м'ясокомбінату (м. Конотоп);
- сироватки крові овець, коней;
- сироватки крові кролів - 117 проб, собак - 85 проб, лисиць - 60 проб, свиней - 10 проб, бабака - 1 проба, людини - 13 проб.
В дослідах були використані наступні прилади та обладнання:
мікроскопи (світлові, люмінесцентні); полістиролові планшети; сухоповітряний термостат - ТC-80; прилад для промивання планшетів - Labsystems Multiwash; центрифуги - centrifuge type MPW-310; фотометр для вимірювання оптичної щільності в лунках планшету - Labsystems Multiskan MS; спектрофотометр СФ-26; фотометр для вимірювання оптичної щільності під час колонкової хроматографії Pharmacia LKB-Uvicord SU; рН-метр; скляні та пластикові флакони; ванночки для реагентів, чашки Петрі; мірні циліндри (500-1000 мл); мікротитраційні піпетки восьмиканальні автоматичні (50 і 100 мкл) Finpippete; піпетки одноканальні автоматичні (50-20, 20-200, 200-1000 мкл); наконечники поліпропіленові до піпеток (20-200 мкл, 200-1000 мкл); фільтрувальний папір.
Під час виконання роботи були використані реактиви за чистотою не менше, ніж "ч.д.а.", зокрема: вода деіонізована; перекис водню 33 % (Н2О2); твін-20; ортофенілендиамін (ОФД); калій фосфорнокислий однозаміщений (КН2РО4); натрій фосфорнокислий двозаміщений (Na2HPO4x12H2O, Na2HPO4x2H2O); натрій фосфорнокислий однозаміщений (NaH2PO4x2H2O); моногідрат лимонної кислоти (С6Н8О7хН2О); бікарбонат натрію (Na2СO3); 2 М H2SO4; хлорид натрію (NaCl); хлорид калію (KCl); гідрохлорид гідроксиламіну (Sigma); поліетиленемін (Sigma), а також препарат антитіл проти імуноглобулінів кроля, помічених пероксидазою (виробництва Інституту епідеміології та мікробіології ім Гамалеї Н.Ф., Москва), кон'югат імуноферментний на основі білку А, помічений пероксидазою хрону (виробництва Інституту Пастера, Санкт-Петербург); міжнародний (МЕБ референс - сироватка) стандарт антирабічної сироватки собаки з активністю 260 МО та 6,7 МО/см3, сухе знежирене молоко.
Вказані реактиви використовувались для приготування наступних розчинів:
- буферний розчин для сорбції антигену ( 0,1 М карбонат натрію -
бікарбонат натрію (КББ), рН 9,6);
-фосфатно-сольовий буферний розчин для промивання планшетів
(рН 7,2-7,4):
розчин А: Na2HPO4x12H2O - 17,9 г, дистильована, підігріта до 40-50 0С вода до 100 мл;
розчин Б: КН2РО4х 2Н2О - 3,4 г, дистильована вода до 50 мл.
До 87 мл розчину А додавали 13 см3 розчину Б, рН 7,2, 8,85 г NaCl та 1г твін-20, ретельно перемішували та доводили до 1000 см3 водою. рН готового буферу має бути у межах 7,2-7,4.
- розчин для розведення сироваток крові імуноферментного кон'югату - 5% розчин сухого знежиреного молока;
-0,1 М цитратно-фосфатний буфер для приготування субстрату, рН 5,2:
готували розчини 0,1 М лимонної кислоти (C6H8O7xH2O 1,05 г розчинити в 50 мл води) та 0,2 М фосфату двозаміщеного (Na2HPO4x2H2O 2,14 г розчинити у 60 мл води). Готовий буфер отримували додаванням до 46,5 см3 0,1 М лимонної кислоти 53,6 см3 0,2 М Na2HPO4x2H2O, рН 5,2.
- 33 % розчин перекису водню.
- розчин субстрату. Готували безпосередньо перед використанням.
У флакон вносили 4 мг ОФД, додавали 10 см3 цитратно-фосфатного буферу та інтенсивно струшували до повного розчинення хромогену;
- розчин для зупинки реакції: 2 М H2SO4. Готували розведенням
концентрованої сірчаної кислоти на дистильованій воді до необхідної концентрації
- розчин для приготування 12% поліакриламідного гелю (на 10 мл):
До 3,3 см3 дистильованої води додавали 3,4 см3 30% акриламід, 2,5 см3 1,5 М трис-НСl (рН 8,8), 0,1 см3 10% SDS, 0,1 см3 10% APS та 0,004 см3 TEMED.
2.2. Методика отримання мозкової суспензії, яка містить вірус сказу
Для цього використовували вірус сказу, штами "Овечий" та "Щелково-51 К".
Штам "Овечий" зберігався у вигляді 20% суспензії мозку мишей. Для отримання достатньої кількості вірусмісткого матеріалу готували 10% суспензію на 0,85% розчині NaCl. Після центрифугування (1000 обертів/ хв) відбирали надосадову рідину та проводили інок