РОЗДІЛ 2
ФІЗИКО-ХІМІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ТА ФУНКЦІЇ ТІАМІНЗВ'ЯЗУЮЧИХ БІЛКІВ
На сьогоднішній день експериментально доведено існування специфічних білків, які беруть активну участь у метаболізмі вітамінів - починаючи від процесів всмоктування в шлунково-кишковому тракті, і до проявлення їх коферментних та некоферментних функцій [1]. Ці білки за функціональними особливостями можна розділити на кілька типів:
1) транспортні білки, які транспортують вітаміни і коферменти. Як правило, це білки крові, зокрема, ТЗБ еритроцитів щурів [24].
2) білки цитоплазматичних мембран, які специфічно акцептують вітаміни та коферменти на поверхні мембран і транспортують їх через біологічні мембрани. Сюди можна віднести ТЗБ мікроорганізмів та рослин [102].
3) білки-ферменти, в результаті взаємодії з котрими проявляться коферментна функція вітамінів, наприклад, ТДФ-зв'язуючі білки щурів [110,111].
4) внутрішньоклітинні білки-рецептори, які беруть участь у реалізації некоферментних функцій вітамінів та їхніх природних метаболітів в організмі людини і тварин.
Остання група білків складає найбільшу цікавість для з'ясування молекулярних механізмів дії вітамінів, проте саме вона є найменш дослідженою. В даному розділі представлені узагальнені матеріали відомих на сьогодні досліджень специфічних білків-акцепторів тіаміну.
2.1. Тіамінзв'язуючі білки мікроорганізмів
Системи транспорту тіаміну в мікроорганізмах, які досліджені переважно на клітинах Escherichia coli [112,113] та дріжджах Saccharоmyces cerevisiae [114], частково на Lactobacillus fermenti [113], L.casei [115], Bacillus cereus [116] і Salmonella typhimurium [117], характеризуються спільними властивостями: кінетикою насичення, субстратною специфічністю, залежністю від енергії, рН і температури середовища, здатністю конкурентно інгібуватися структурними аналогами тіаміну. Кінетичні характеристики транспорту тіаміну у мікроорганізмів відображені в таблиці 2.1.
Таблиця 2.1
Транспорт тіаміну у різних мікроорганізмів
Об'єкт дослідженьрН -
оптимумКm1, МКm2, МІнгібіториАктиваториEscherichia coli
сrookes [113]
8,0
5,0·10-8
8,0·10-7ПТ, ОТ, TДФ, азид, цианід, динітрофенол,
Глюкоза, Mg2+Escherichia coli K12
KG33mutant [118]
6,5
8,3·10-7ПТ, ОТ, TДФ, йодоацетамід
ГлюкозаEscherichia coli K12
KG1676 mutant [119]
6,0
5,9·10-9ОТ, ПТ, азид, цианід, динітрофенол, глюкозаLactobacillus fermenti [113]6,54,8·10-7Йодацетамід, ПТГлюкоза, Mg2+, К+Lactobacillus casei[115]6,8< 10-8TДФ, йодацетамідГлюкозаSalmonella typhimurium [117]6,8 - 7,02,1·10-7ОТ, азид, цианідГлюкозаBacillus cereus [116]6,52,0·10-8ПТ, ЕДТА, Н+К+, Са2+, Mg2+Saccharomyces cerevisiae [120]4,51,8·10-7Цианід, ПТ, азид Глюкоза
Детально механізм транспорту тіаміну досліджений в клітинах E.coli [2,112,113], де 95% тіаміну представлено ТДФ. Тіамін проходить через клітинну мембрану у вільному стані, перетворюється у ТДФ на її внутрішній стороні. Надходження тіаміну в клітину відбувається за участю специфічного білкового переносника, який функціонує за механізмом полегшеної дифузії [22].
Дослідження транспорту тіаміну у E.coli проводились на трьох рівнях: цілих клітинах, везикулах мембран і ТЗБ [113]. Показано, що інтактні клітини і везикули Е.coli мають ділянки з високою та низькою спорідненістю до тіаміну. При низьких концентраціях тіаміну в середовищі функціонує ділянка з високою спорідненістю, а при високих - з низькою. Про виділення ТЗБ з різних штамів E.coli повідомили три групи науковців: японські вчені на чолі з Hayashi R. [112] отримали ТЗБ з чистотою 86%, Мm дорівнювала 36 кДа, величина Кd - 2·10-8 М. Дослідники з Оклахоми на чолі з Leach F. [113] виділили ТЗБ хроматографією на гідроксилапатиті. Білок був очищений в 230 разів, його Мm - 35 кДа, а Кd дорівнювала 5·10-8 М. Третя група вчених з Кіото на чолі з Nose Y. [118], в 90 раз очистили ТЗБ методом афінної хроматографії. Молекулярна маса білка 38 кДа; Кd - 0,2·10-8 М. Згодом, був клонований периплазматичний ТЗБ Е.coli [121]. З'ясовано, що білок є мономером з молекулярною масою 34,2 кДа, специфічно взаємодіє з тіаміном, Кd дорівнює 0,8 мкМ.
Дослідження активного транспорту тіаміну в клітини Sac.cerevisiae підтвердили наявність специфічного білкового переносника [122]. Найбільш ймовірно, що він або вони тісно зв'язані з мембраною, оскільки ТЗЗ фіксувалась в екстрактах клітин лише після обробки ультразвуком.
В клітинах Sac.cerevisiae виявлено два види ТЗБ - розчинний та мембрано-зв'язаний. З осмотичної рідини методами хроматографії на ДЕАЕ-целюлозі і ультрафільтрації виділений розчинний ТЗБ [120], молекулярною масою 140 кДа. Білок очищений в 400 разів, його ТЗЗ становила 10,3 нмоль/мг, рН-оптимум для зв'язування 5,2-5,5, а Кd - 2,9·10-8 М (табл.2.2). Пізніше було показано, що розчинний ТЗБ є ідентичним з тіамін-репресуючою кислою фосфатазою [123], яка бере участь в гідролізі екзогенних ФЕТ в периплазматичному просторі. Фермент був виділений під час процесу очищення ТЗБ. Генетичним аналізом виявлено ген РНО3, що кодує розчинний ТЗБ в клітинах Sac.cerevisiae [124].
Встановлено, що мутанти Sac.cerevisiae з порушеним транспортом тіаміну і вихідний штам містять близькі кількості розчинного ТЗБ. Це вказує на те, що білок не є транспортним, а для транспорту тіаміну через мембрану необхідний інший білковий компонент. З фракції мембран виділений мембранозв'язаний ТЗБ [120,125], Кd якого дорівнювала 0,17 мкМ при оптимумі рН 5,0, що майже співпадає з уявною Кm транспорту тіаміну у Sac.cerevisiae. ТЗЗ мембранної фракції мутанта з порушеним транспортом тіаміну (PT-R2) складає лише 3% від ТЗЗ вихідного штаму Sac.cerevisiae. Отже, локалізація мембранного тіамінзв'язуючого білка, подібність кінетичних констант, паралелізм в регуляції транспорту та ТЗЗ, дефіцит ТЗБ у мутанта з порушеним транспортом, дозволяє стверджувати, що мембранний ТЗБ Sac.cerevisiae бере безпосередню участь у транспорті тіаміну. Роль в цьому процесі інших