РОЗДІЛ 2
ОБ'ЄКТ, УМОВИ ПРОВЕДЕННЯ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об'єкт та умови проведення лабораторних досліджень
В лабораторних експериментах об'єктами досліджень були рослини гібридів кукурудзи (Zea mays L.) Дніпровський 310 (середньостиглий) та Дніпровський 284 (ранньостиглий). Однією з причин використання кукурудзи в якості об'єкта досліджень є те, що дана культура є зручною для постановки модельних експериментів і є однією з найбільш поширених сільськогосподарських рослин нашого регіону. В більшості модельних експериментів нами були застосовані рослини гібриду Дніпровський 284, так як він є чутливішим за Дніпровський 310 [18].
Для постановки модельного експерименту відбирали неушкоджене насіння кукурудзи в кількості близько 100 насінин на кожний зі зразків.
Перед висаджуванням рослин їх зернівки піддавали обробці розчином 3% перекису водню. Насіння замочували на 4 години, потім пророщували у термостаті (t - + 27(С) дві доби на проточній воді до появи корінців. Після цього проростки висаджували на дослідні середовища з іонами нітратів свинцю (Pb(NO3)2) та кадмію (Cd(NO3)2) у концентраціях 1(10-4 моль/л та 1(10-5 моль/л, або ж гербіциди в концентраціях 2,07·10-4 моль/л та 4,14·10-4 моль/л (по вмісту ацетохлору). Дослідні концентрації важких металів підбирали шляхом визначення їх максимально наближених доз в оточуючому середовищі, а також тих концентрацій, під впливом яких спостерігається видимий токсичний ефект на рослинах, але в цілому рослинний організм здатний далі розвиватись. В попередніх дослідженнях з використанням розчинів з різним вмістом гербіциду трофі від 0,615; 0,246; 0,123; 0,06 та 0,02 г/л було зв'ясовано, що концентрація 4,6·10-4 моль/л є оптимальною. При такій концентрації реєструвалась висока токсична дія, однак ростові процеси рослин продовжувались. В перерахунку на діючу речовину трофі (ацетохлор, Mr=269), отримали концентрацію діючої речовини в розчинах - 4,14·10-4 моль/л. У кожному з експериментів контролем слугувала дистильована вода.
При проростанні рослин з кожного дослідного варіанту проводили добір зернівок та колеоптилів на четверту, п'яту, шосту, сьому та дев'яту доби. Відібране зерно висушували в термостаті при температурі 35(С, а колеоптилі заморожували в морозильній камері для подальшої їх обробки. В цьому випадку вибір колеоптилів обумовлений тим, що в даному органі рослин міститься значна частка мікросомальних фракцій рослин, а значить і ліпідів мембранних структур, вивчити вміст і співвідношення яких у результаті дії стресорів було одним із головних завдань даної роботи. Одержаний рослинний матеріал підлягав аналізу на визначення компонентного складу загальних ліпідів, фосфоліпідів, вільних жирних кислот та активності ліпаз.
Дослідні варіанти:
Вплив важких металів на ліпіди ендосперму проростків гібриду кукурудзи Дніпровський 284
1. Контроль
2. ((2+ - 1( 10-4 моль/л;
3. (( 2+ - 1( 10-5 моль/л;
4. (( 2+ - 1( 10-4 моль/л;
5. (( 2+ - 1( 10-5 моль/л;
6. (( 2+ - 1( 10-4 моль/л + (( - 1( 10-4 моль/л;
7. (( 2+ - 1( 10-5 моль/л + (( - 1( 10-5 моль/л.
Ліпіди мікросомальних фракцій колеоптилів кукурудзи при дії іонів свинцю та кадмію
1. Контроль;
2. (( 2+ - 1( 10-4 моль/л;
3. (( 2+ - 1( 10-4 моль/л;
4. (( 2+ - 1( 10-4 моль/л + (( - 1( 10-4 моль/л;
Вивчення дії гербіцидів на ліпідні комплекси в модельному експерименті
Колеоптилі : 1. Контроль
2. Ацетохлор - 4,14·10-4 моль/л.
Ендосперм: 1. Контроль
2. Ацетохлор 1,25 мг/л (0,46·10-5 моль/л)
3. Ацетохлор 2,5 мг/л (0,93·10-5 моль/л)
4. Ацетохлор 5 мг/л (1,9·10-5 моль/л)
5. Ацетохлор 20 мг/л (7,4·10-5 моль/л
6. Ацетохлор 50 мг/л (1,9·10-4 моль/л)
7. Ацетохлор 100 мг/л (3,7·10-4 моль/л)
Сумісна дія важких металів та хлорорганічного гербіциду на вміст ліпідів ендосперму та колеоптилів проростків кукурудзи
1. Контроль
2. (( 2+ - 1( 10-4 моль/л + ацетохлор - 4,14·10-4 моль/л
3. (( 2+ - 1( 10-4 моль/л + ацетохлор - 4,14·10-4 моль/л
4. ((( + (()2+ - 1( 10-4 моль/л + ацетохлор - 4,14·10-4 моль/л
2.2. Методи досліджень
2.2.1. Екстракція сумарних ліпідів із рослинних тканин
Для вилучення ліпідів з нефотосинтезуючих рослинних тканин або з фотосинтезуючих тканин, що містять легко дезактивуючі ферменти, застосовували модифікаційний метод Блайа і Дайера [111], в основі якого лежить примінення полярного і неполярного розчинника в суміші, що дозволяє зруйнувати ліпопротеїнові комплекси і провести повне вилучення зв(язанних ліпідів.
Наважку 0,2 г розмеленого борошна зерна кукурудзи заливали 8 мл суміші хлороформ : метанол (1: 2 по об(єму), гомогенізували (2 хв), після чого центрифугували (5 хв) при швидкості 3500 об/хв. Надосадкову рідину зливали в роздільну лійку. В цю ж пробірку з осадом приливали по 9 мл суміші хлороформ : метанол : вода в об(ємі 1 : 2 : 0,8, повторно гомогенізували та центрифугували.
Надосадкову рідину зливали в ту ж роздільну лійку. Додавали по 8 мл хлороформу, дистильованої води, струшували й залишали стояти для розділення хлороформного і водно-метанольного шарів. Нижній хлороформний шар збирали, додавали Na2SO4 безводний та залишали на ніч у холодильнику. Хлороформний шар фільтрували й концентрували в потоці азоту, після чого додавали 100 мкл гексану.
2.2.2. Тонкошарова хроматографія (ТШХ) сумарних ліпідів
ТШХ проводили за методикою Кейтса [28]. Для розділення сумарних ліпідів використовували систему розчинників гексан : діетиловий ефір : метанол : льодяна оцтова кислота = 9 : 2 : 0,2 : 0,3. Цю суміш заливали в камеру для ТШХ та залишали на годину для насичення парами розчинника. ТШХ проводили на силикагельних пластинах марки "Silufol" з розміром частинок 2,5 - 7,5 мк. Перед нанесенням ліпідного екстракту хроматографічні пластинки активували протягом 20 хв. при t = 110°С в термостаті. Екстракти сумарних ліпідів (в кількості 5-10 мкл) наносили мікрошприцем або капіляром на