РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Материалом для исследований служили искусственная полиплоидная форма мяты
канадской (Мentha canadensis K 59), и дикорастущая форма мяты водяной (M.
аquatica K 6), а также межвидовые гибриды F1, полученные с их участием. Форма
Мentha canadensis K 59 (4n) была получена методом экспериментальной полиплоидии
в середине 70-х годов Л.А. Бугаенко и характеризовалась наибольшей масличностью
(массовая доля эфирного масла 6.1-6.2 %), а М. aquatica К 6 - дикорастущая
форма, интродуцированная из Дагестана и изученная в коллекции ИЭЛР,
характеризовалась низким уровнем масличности (массовая доля эфирного масла
0.9-1.0 %), но была устойчива к ржавчине и зимостойка [12].
Ранее было установлено [12], что при скрещивании указанных видов (Мentha
canadensis К 59(4n) х М. aquatica K6) в гибридном потомстве наблюдался довольно
широкий диапазон изменчивости по массовой доле эфирного масла (от 2 до 6 %),
что позволило эффективно производить отбор высокомасличных генотипов,
накапливающих более 4 % эфирного масла. При этом более 80 % гибридных растений
проявляли гетерозисный эффект по масличности. Селекционная работа с этой
комбинацией привела к созданию в 1985 году высокомасличного сорта
Симферопольская 200 (массовая доля эфирного масла 4,6 %) (рис.2.1) [13].
В исследования были включены как высокомасличные гибриды указанной комбинации,
так и генотипы со средним и малым значением массовой доли эфирного масла
(таблица 2.1).
Растения выращивали в полевых условиях на коллекционном участке Института
эфиромасличных и лекарственных растений УААН, расположенном в предгорной зоне
Крыма, а также в условиях закрытого грунта в вегетационных сосудах (объем
сосудов 10 литров). Отбор материала
Рис.2.1. Высокомасличный сорт Симферопольская 200
Таблица 2.1
Массовая доля эфирного масла в листьях исследуемых видов и гибридов мяты
Исследуемые виды и гибриды мяты
Массовая доля эфирного масла на абсолютно сухую массу листьев, %
по данным 2000г.
по многолетним данным
M. сanadensis K 59 (4n)
M. aquatica K 6
Симферопольская 200
88.16.142
88.16.144
92.4.136
92.4.168
92.4.317
93.4.2
98.2.11
98.2.3
99.3.11
99.3.13
99.3.14
99.3.22
99.3.31
99.3.39
4,00
3,40
3,20
4,40
3,80
4,00
3,40
3,20
3,40
4,40
3,80
4,00
4,00
3,40
3,50
4,00
2,50
4,57
3,40
3,20
4,85
4,35
4,75
2,85
3,70
3,00
(апексы, бутоны, листья) проводили в утренние часы на различных стадиях
вегетации растений.
Для изучения железистых структур материал отбирали на следующих стадиях
развития листа: I- апикальные меристемы верхушечных и пазушных почек, II -
первая пара листовых примордиев, III - вторая и третья пара листовых
примордиев, IV - молодые листья длиной 0.5 см, V -молодые листья длиной 1 см,
VI - листья, закончившие рост.
Высечки листьев брали отдельно из основания, средней части и верхушки листовой
пластинки. Фиксацию материала проводили различными способами в зависимости от
требований, предъявляемых методами последующих исследований.
Все исследования выполняли в период с 1996 по 2002 годы. Для изучения
особенностей дифференциации и функционирования эфиромасличных железистых
структур мяты использовали следующие основные методы.
1. Анатомия и морфология. Изучение анатомо-морфологических особенностей
развивающихся листьев мяты проводили на постоянных и временных препаратах.
Свежие срезы и ткани, раздавленные на предметных стеклах, окрашивали основным
фуксином по Модилевскому [75], кармином по Сноу [66] и заключали в глицерин,
постоянные препараты готовили по общепринятым методикам [65]. Помимо этого,
морфологию клеток и тканей также изучали параллельно с кариометрическим и
цитохимическим анализом на препаратах, приготовленных по соответствующим
методикам. Исследования проводили под световым микроскопом Люмам И-1 и
интерференционно-поляризационным микроскопом MPI-5.
Для подсчета эфиромасличных железистых структур использовали метод Л.М.
Теплицкой [75] в нашей модификации. Закончившие рост листья 5-8 пары отбирали с
побегов второго порядка, зарисовывали и определяли площадь листовой пластинки.
Затем у листьев удаляли основание с черешком, верхушку и края, оставляя среднюю
1/3 часть. Высечки помещали на холод до полного промораживания. Отделение
эпидермы с абаксиальной поверхности листа проводили по методу Д.Н. Анели [1].
Фрагменты эпидермы фиксировали по Карнуа [54] в течение 2 часов при температуре
0 єС. После обесцвечивания проводили окрашивание фрагментов эпидермы в реактиве
галлоцианин-хромовые квасцы. Из окрашенных фрагментов готовили временные
препараты с заключением материала в глицерин, которые анализировали под
световым микроскопом Люмам И-1. Оптическое оснащение микроскопа: окуляр х7,
объектив х10, бинокулярная насадка х2,5. Подсчет количества железок и
железистых волосков проводили на нижней эпидерме листа на площади, ограниченной
окулярной рамкой (0,52 х 0,52 мм). Для определения средней арифметической объем
выборки составлял не менее 30 полей зрения.
2. Цито- и кариометрия. Измерения объемов клеток, ядер и ядрышек проводили на
срезах и временных давленных препаратах. Материал фиксировали по Карнуа.
Препараты окрашивали галлоцианин-хромовыми квасцами (ГХК) по Эйнарсону в
модификации де Бэра и Сарнакера [67]. Методика этих исследований включала
микрофотосъемку отдельных клеток и групп клеток с помощью микрофотонасадки
МФН-12.1 на фотопленку Микрат 300 и CONICA 200.
Для определения объема ядер и ядрышек проекции негатива анализировали с помощью
специально разработа