РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ПРОВЕДЕНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ
Відповідно до поставленої мети обстежено 91 жінку клімактеричного періоду, хвору на ПОХ.
Всi хворi були обстеженi за допомогою загальноприйнятих терапевтичних, неврологічних, ортопедичних методiв об'єктивного та спецiального дослiдження, а також з використанням стандартних та спецiальних лабораторних обстежень.
Комплекс лабораторних досліджень, окрім загальноприйнятих, включав визначення рівня ЕІ та денситометрію.
Субстратом лабораторного дослiдження була кров. Забiр венозної кровi проводили з лiктьової вени зранку натще. Пробiрки розмiщували на 35 хв у термостат при температурi 37?С, пiсля чого вiдшаровували згусток i центрифугували протягом 20 хв при 1500 об/хв. Сироватку вiдсмоктували в суху пробiрку i залежно вiд методики дослiдження зразу використовували для аналiзiв або зберiгали в холодильнику при температурi +4-6?С.
У процесi виконання роботи використовували рентгенологічні, бiохiмiчнi та статистичнi методи аналiзу клiнiчного матерiалу.
2.1. Методи дослідження ендогенної інтоксикації організму
Відомо, що складовими синдрому ендогенної інтоксикації є дві найсуттєвіші патогенетичні ланки: ендотоксемiя - вміст і розповсюдження в циркулюючій крові токсичних агентів у тій чи іншій концентрації та ендотоксикоз - закономірний несприятливий результат впливу зазначених чинників на органи i системи всього органiзму [59]. На пiдставi цього для визначення рівня ЕІ використовували діагностичні тестові реакції, спрямовані на виявлення як рiвня ендотоксемiї (CТ, СМП), так і ендотоксикозу (СТК, АРКК). Такий методологічний підхід дозволив об'єктивізувати глибину враження тканин, органів і систем, спричиненого агресією токсичних метаболітів.
Ендотоксемію оцінювали біологічним методом. Тест-об'єктом були живі сперматозоїди бика [59,109]. Принцип методики полягає у неоднаковій здатності живих і загиблих під впливом токсичного чинника клітин дифузно сприймати різні барвники, тобто забарвлюватись у різні кольори: у голубий (живі) або червоний (загиблі клітини).
Одночасно рівень ендотоксемії оцінювали за вмістом молекул середньої маси (СМП), визначеним за методикою Н.І. Габрієляна та співавт. (1981) у модифікації Д.Л. Брасюка (1995) [59].
Параметри ЛІІ, ГПІ, АРКК та СТК свідчили про рівень ендотоксикозу.
ЛІІ, запропонований Кальф-Каліфом Я.Я., розраховували за формулою:
ЛІІ = (4М+3Ю+2П+С)((Пл+1):(Л+Мн)((Е+1), (2.1.1)
де М - мієлоцити, Ю - юні, П - паличкоядрові лейкоцити, Пл -плазмоцити, С - сегментоядрові лейкоцити, Л - лімфоцити, Мн - моноцити, Е - еозинофіли.
У здорових людей ЛІІ не перевищує, як правило, 0,3-1,0. Підвищення індексу свідчить про інтоксикацію організму.
Гематологічний показник інтоксикації визначали способом, запропонованим Васильевим В.С, Комаром В.И. [59].
Разом з тим, встановлювали АРКК та СТК.
Виходячи з розуміння патофізіологічної ролі процесів, ініційованих дією токсичних агентів на клітину як структурно-функціональну одиницю тканини організму, об'єктивним критерієм ступеня важкостi ЕІ є реакція токсиномодульованого кислотного гемолізу (РТКГ), яка вказує на антитоксичну резистентність еритроцитів (АРЕ).
Даний дiагностичний тест базується на проведенні вказаної реакції з капiлярною кров'ю, отриманою шляхом проколу пальця до i пiсля накладання пневматичної манжети вiд тонометра (для накопичення у периферичній крові ендотоксинів). Ступiнь затискання вен руки стандартизується дотриманням певного рiвня дiастолiчного артерiального тиску.
Хід дослідження. Робочу сумiш еритроцитiв готували шляхом змiшування 0,1 мл нативної кровi з 0,9 мл iзотонiчного розчину хлориду натрiя. Для дослiдження брали двi проби кровi - контрольну i дослiдну (пiсля 15-хвилинного накладання пневмоманжети).
Для визначення контрольного рiвня реакції у вимiрювальну кювету фотоелектроколориметра вносили 0,2 мл робочої сумiшi еритроцитiв i змiшували з 1,8 мл iзотонiчного розчину хлориду натрiя. Кювету вставляли у вимiрювальну комiрку фотометричного приладу i вносили стандартний гемолiтик - 2,0 мл 2 мМ HCl на iзотонiчному розчинi NaCl, після чого визначали результат за зниженням екстинкцiї iнкубацiйної сумiшi. Аналогiчно проводили реакцію з дослiдною порцiєю кровi.
Далi будували криву швидкостi гемолiзу, користуючись вiдомим потрiйним правилом, згiдно якого розраховували показник процентного спiввiдношення (Х %) змiни екстинкцiї мiж двома послiдовними вимiрюваннями (наприклад, Eзо? - Ео?, Е60? - Eзо?, Е90? - Е60? i т.д.) i максимальною амплiтудою екстинкцii (En - Eзо?), яку приймали за 100 %. За значеннями X будується графiчна залежнiсть f = Xi(i).
Похiднi кривi гемолiтичних реакцiй - контрольної i дослiдної - аналiзуввали за двома її головними параметрами: значенням максимальної швидкостi гемолiзу, тобто амплiтуди, та часом її досягнення з визначенням iндекса модульованого гемолiзу (IАРЕ) за формулою:
IАРЕ = am?tm / аk?t k, де (2.1.2)
ak i am - значення амплiтуд контрольної i дослiдної реакцiй, tk i tm - час досягнення пiкових значень цих реакцiй вiдповiдно. Змiни швидкостi РТКГ з високою точнiстю i вiдтворюванiстю вiдображають рiвень ендотоксикозу, про який свідчила величина індекса IАРЕ (табл.2.1.1).
Реакцiю iзольованих лейкоцитiв (антитоксична резистентність лейкоцитів - АРЛ) на дiю токсичних агентiв у сироватцi кровi дослiджували методом вторинної (індукованої) люмiнесценцiї з використанням водного розчину флюорохрому акридину оранжевого в робочому розведеннi 1:10000 (рН = 5,6 ) [59].
Бiофiзична сутнiсть методу полягає в тому, що пiд впливом токсичних продуктiв вiдбуваються кiлькiснi та якiснi змiни внутрiшньоклiтинних бiоенергетичних процесiв, про якi можна судити за характером спектрального перерозподiлу картини люмiнесцентного світіння ядер дослiджуваних клiтин. Молекули флюо