розділ 2.7.4). Оцінювали ступінь РБТЛ
за індексом стимуляції (ІС) лімфоцитів при різній довжині хвилі (530 нм і 640
нм). ІС обчислювали за формулою (на прикладі довжини хвилі 640 нм):
ІС= (І у.о.640 нм стим./ І у.о. 640 нм нестим. - 1) . 100 %,
де І у.о. 640 нм стим - інтенсивність люмінесценції стимульованого зразка при
довжині хвилі 640 нм, в умовних одиницях;
І у.о. 640 нм нестим. – інтенсивність люмінесценції нестимульованого зразка при
довжині хвилі 640 нм, в умовних одиницях;
ІС - індекс стимулювання культури лімфоцитів, у відсотках.
2.5 Приготування тканинних антигенів
Тканинні антигени готували з 4 (головний мозок) - 5 (тимус) зразків заморожених
органів від мертвонароджених дітей без гістологічно видимих дефектів зазначених
органів відповідно до рекомендації проф. О. Е. В’язова і проф. Ш. Х. Ходжаєва
[161]. Отриману надосадову рідину, яка містила тканинні пептидні комплекси,
приймали за антиген. Концентрацію білка в тканинних екстрактах визначали за
Лоурі [144]. Концентрація білка в тимічному антигені складала 1,2 мг/мл, в
антигені головного мозку – 1,2 мг/мл. Отримані антигени стерилізували через
бакфільтри (Синпор) із діаметром пор 0,23 мкм і зберігали до використання при
температурі –200С. Перед постановкою РБТЛ порцію антигену разморожували і
використовували для стимуляції лімфоцитів однократно в концентрації 15 мкг/мл.
2.6 Непрямий варіант визначення поверхневих антигенів лімфоцитів за допомогою
моноклональних антитіл до CD3, CD4, CD8, CD16, CD20, CD25
Визначення рівня експресії поверхневих антигенів здійснювали постановкою
непрямого варіанта імунофлуоресцентного методу з використанням методики і
наборів моноклональних антитіл (МКАТ), придбаних в Інституті експериментальної
патології, онкології та радіобіології ім. Р. Е. Кавецького НАН України (м.
Київ). В експериментах in vitro та in vivo проводили фенотипування лімфоцитів
МКАТ популяційного (CD3, CD16, CD20) та субпопуляційного (CD4, CD8) спектра, а
також проти активаційних антигенів (CD25, рецептор до ІЛ-2).
До антиген-позитивних лімфоцитів відносили клітини, поверхня яких не менше, ніж
на 2/3 містила флуоресцентний барвник. Кількість антиген-позитивних клітин
визначали як відсоток флуоресціюючих клітин при перегляді 200 лімфоцитів при
вирахуванні відсотка флуоресціюючих клітин (при їх наявності) у препараті
негативного контролю.
2.7 Імуногенезні (патогенетичні) методи
2.7.1 Цитогенетичний метод
Цитогенетичний метод оцінки лімфоцитів застосовували в дослідженнях тривалої
культури і при короткостроковому культивуванні лімфоцитів.
Добір метафаз для цитогенетичного аналізу проводили з урахуванням наступних
вимог: 1) у метафазній пластинці повинний бути повний набір хромосом; 2)
хромосоми повинні чітко ідентифікуватись, накладення хромосом не повинно
утрудняти їх визначення; 3) форма метафазої пластинки округла, із рівномірно
розподіленими хромосомами середнього ступеня спіралізації.
У препаратах вивчали 100 клітин, які знаходились в стані метафази, ушкоджені
гіпотонічним шоком не враховували. При аналізі 100 метафазних пластинок
керувалися загальноприйнятими критеріями тестування асоціацій акроцентричних
хромосом [162].
У кожній метафазній пластинці визначали кількість акроцентриків, які
асоціюють. У залежності від кількості асоціюючих акроцентричних хромосом
складали варіаційний ряд класів лімфоцитів (КЛ) від КЛ 0 до КЛ 10 і визначали
відносне й абсолютне значення частоти класів без асоціацій і з двома
асоціюючими АХ (КЛ 0+2 ААХ), які є ранніми (недавно утвореними) активованими
лімфоцитами [135]. До КЛ 3-10 ААХ відносяться довго циркулюючі клітини, так як
вже після трьох мітозів асоціації акроцентричних хромосом руйнуються.
Гістограма розподілу класів лімфоцитів за кількістю акроцентричних хромосом у
асоціаціях на основі цитогенетичного аналіза лімфоцитів периферичної крові 22
донорів (рис. 2.1) виявив градаційний провал між КЛ 0+2 ААХ і КЛ 3-10 ААХ, що
підтверджує функціональну активність перших двох класів (КЛ 0 ААХ та КЛ 2 ААХ,
у сумі КЛ 0+2 ААХ).
Рис. 2.1. Гістограма розподілу цитогенетичних класів лімфоцитів у донорів
середнього віку (n=22)
2.7.2 Цитоморфометричний метод
Цитоморфометричні дослідження проводили в мазках паралельно з визначенням
лейкоцитарної формули крові шляхом виміру діаметра 200 лімфоцитів на площі
половини мазка, приготовленого з відповідного зразка крові або плеврального
ексудата. Для приготування мазка з плеврального ексудата зразок попередньо
центрифугували 5 хвилин при 1000 об./хв. для концентрування клітинних елементів
[155]. При приготуванні мазка з плеврального ексудата керувалися правилами
готування гематологічних препаратів. Виміри лімфоцитів при цитоморфометричному
аналізі здійснювали при збільшенні об. 100х; ок. 7х за допомогою
окуляр-мікрометру, ціну розподілу якого в мікрометрах (мкм) встановлювали за
об'єкт-мікрометром [163, 164]. Визначали два діаметри лімфоцита – максимальний
і мінімальний, потім встановлювали його середнє значення. Складали варіаційний
ряд з інтервалом у 1 мкм. Лімфоцити були об'єднані в групи: малі лімфоцити, із
діаметром до 6,0 мкм (КЛЈ6,0 мкм); середні, із діаметром від 7 до 9 мкм (КЛ 7-9
мкм); великі – 10 мкм і більше (КЛ?10 мкм). Їх різна функціональна значимість
підтвердилась розподілом цитоморфометричних класів лімфоцитів на гістограмі
здорових донорів (рис. 2.2) та різною динамікою у культурі лімфоцитів та крові
хворих осіб. Крім варіації частот розмірних класів при цитоморфометричному
аналізі обчислювали середній діаметр лімфоцитів у препараті та введений для
зручності інтепретації даних, отриманих у різних лабораторіях й уніфікації
цитоморф
- Київ+380960830922