РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Реактиви
У роботі були використані такі реактиви та матеріали: нітросиній тетразолій НСТ
(3–(4,5–диметил–2–тіазоліл)–2,5–дифеніл–2Н–тетразолію броміду) (Sigma, США),
середовище “RPMI”–1640, трис–HCl (Sigma, США), HEPES (SERVA, США),
поліетиленгліколь–6000 (ПЕГ–6000) (Ferak, Німеччина), антитіла проти
імуноглобулінів мишей, мічені пероксидазою (Amerscham, Англія).
Інші реактиви (бромтимолблау, трипановий синій, фікол, верографін, глюкоза,
етиловий спирт, сірчана кислота, трихлороцтова кислота, сульфат магнію, хлорид
кальцію, хлорид натрію, гідроокис калію, натрій фосфорнокислий одно замісний,
натрій оцтовокислий, калій фосфорнокислий двозамісний, гепарин,
диметилсульфоксид (ДМСО), ембріональна теляча сироватка, глутамін, гентаміцин,
мономіцин вітчизняного виробництва кваліфікації хч та охч.
2.2. Умови постановки експерименту
Дослідження впливу саліцилальімінатів та їх похідних на біологічний об’єкт
проводили на двох рівнях: клітинному (in vitro) та на рівні цілого організму
(in vivo).
1. В експериментах in vitro було досліджено такі показники –функціональна
активність перитонеальних макрофагів, величина електрокінетичного потенціалу
лімфоцитів, макрофагів і еритроцитів, бактеріостатична дія саліцилальімінатів.
2. В експериментах in vivo були досліджені такі показники –динаміка вмісту
лейкоцитів, функціональна активність нейтрофілів у крові щурів, у мишей з
пухлинним ростом оцінювали показники виживаності, динаміку росту пухлини,
величини цитотоксичної активності лімфоцитів, рівні ЦІК і протипухлинних
антитіл у крові в ІФА-тесті, активність макрофагів в спонтанному НСТ-тесті, дію
класичної і модифікованої (досліджуваними сполуками) протипухлинної вакцини
оцінювали за показниками виживаності, динамікою росту пухлини, величиною
цитотоксичної активності лімфоцитів, рівнем ЦІК і протипухлинних антитіл у
крові в ІФА-тесті, активністю макрофагів в спонтанному НСТ-тесті.
В експериментах використовували мишей чистих ліній та щурів віварію Інституту
експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН
України та Київського національного університету імені Тараса Шевченка. В
дослідженнях були використані такі лінії тварин:
миші–самці лінії Ваlb/c – білої масті, генетична формула в, с, алель основного
локусу тканинної сумісності H–2d. Миші дуже чутливі до лейкозогенних і
пухлиноіндукуючих вірусів. Частота пухлин молочних залоз дуже низька (до 5%). У
мишей відсутній фактор молока (ММТV) [200];
щури–самці лінії Вістар – білої масті, альбіноси. Частота пухлин: карцинома
вилочкової залози 27-40%, феохромоцитома 20%. Середня тривалість життя 31
місяць [200].
2.3. Досліджувані сполуки
Нанокомпозити фулерену С60 одержували за методом [201]. Концентрація фізично
адсорбованих фулеренів на поверхні аеросилу (площа поверхні 290 м2/г) складала
0,15 mмоль/м2. Концентрація хемосорбованих фулеренів на амінопропілаеросилі
складала 0,51 mмоль/м2 при концентрації аміногруп 3,1 mмоль/м2.
Нанокомпозити саліцилальімінів отримували за методом [202]. Концентрація
саліцилальімінуаеросилу (СІА) складала 3,1 mмоль/м2, купруму (ІІ) (CuСІА) – 0,5
mмоль/м2, ванадію (ІІ) (VOСІА) – 0,51 mмоль/м2, мангану (ІІ) (MnСІА) – 0,17
mмоль/м2 та цинку (ІІ) (ZnСІА) – 0,51 mмоль/м2.
2.4 Виділення клітин
2.4.1. В и д і л е н н я с п л е н о ц и т і в м и ш е й. Лімфоцити отримували
методом градієнтного центрифугування суспензії клітин [203]. Тварин
декапітували, селезінку переносили в охолоджене живильне середовище RPMI–1640.
Тканину селезінки відокремлювали від сполучнотканинної капсули та перетирали
через 4 шари нейлону у співвідношенні 250 – 300 мг тканини на 5 мл буферу
такого складу (мМ): Na2HPO4 – 3, KCl – 5, NaCl – 120, CaCl2 – 1, глюкоза – 10,
MgSO4 – 1, NaHCO3 – 4, HEPES – 10, рН 7,4.
Спленоцити отримували методом градієнтного центрифугування суспензії клітин
селезінки [203]. На дно пробірок, що містили 5 мл суспензії, за допомогою
шприца вносили 2,5 мл розчину фікол–верографіну (с = 1,077). Проби
центрифугували
1500 хв-1, 40 хв. На межі розділу фаз відбирали фракцію лімфоцитів, які двічі
відмивали у буфері такого складу (мМ): Na2HPO4 – 3, KCl – 5, NaCl – 120, CaCl2
– 1, глюкоза – 10, MgSO4 – 1, NaHCO3 – 4, HEPES – 10, рН 7,4, 1000 хв-1, 5 хв.
Кількість життєздатних лімфоцитів підраховували у камері Горяєва з
використанням 0,4% розчину вітального барвника трипанового синього. Лімфоцити
ресуспендували в середовищі RPMI–1640 і використовували у той же день.
Кількість лімфоцитів підраховували за допомогою світлового мікроскопу Biolam
„ЛОМО” Р12 у камері Горяєва з використанням 0,2% розчину трипанового синього.
Робочі суспензії лімфоцитів готували у середовищі RPMI–1640 з додаванням 8 мМ
NaHCO3 як джерела екзогенного HCO3–, 20 мМ HEPES та 10% ембріональної телячої
сироватки для збереження високої буферної ємності середовища та стабілізації
плазматичної мембрани клітин, що дозволило підтримувати
функціонально–метаболічний стан ізольованих клітин протягом тривалої
інкубації.
2.4.2. В и д і л е н н я т и м о ц и т і в щ у р і в. Після декапітації тварини
проводили розтин грудної порожнини, обережно, щоб не пошкодити кровоносні
судини, вилучали тимус та поміщали його у середовище RPMI–1640 або буфер такого
складу (мМ): Na2HPO4 – 3, KCl – 5, NaCl – 120, CaCl2 – 1, глюкоза – 10, MgSO4 –
1, NaHCO3 – 4, HEPES – 10, рН 7,4.
Тимус відділяли від сполучної тканини та кровоносних судин і перетирали через
чотири шари нейлонової сітки у буфері для виділення. Загальний об’єм доводили
до 10 мл. Суспензію клітин двічі відмивали центрифугу
- Київ+380960830922