РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Для оцінки стану системи імунітету можуть використовуватись лабораторні тести різного рівня. Найбільш часто визначають вміст цитокінів в сироватці крові, а також продукцію цитокінів in vitro лейкоцитами донорів у відповідь на стимуляцію. Важливим є показник спонтанної продукції цитокінів Т-лімфоцитами, що характеризує ступінь активації клітин в організмі людини. Індуковану продукцію цитокінів оцінюють після дії на клітини мітогенів - ФГА або ЛПС. Саме визначення спонтанної та індукованої продукції цитокінів Т- хелперами 1 та II типів ми використовували для оцінки впливу препарату Ербісол на імунокомпетентні клітини.
2.1. Характеристика об'єму вивченого матеріалу
Проведені дослідження спонтанної та індукованої мітогенами (ФГА, ЛПС) і препаратами Ербісолу (Ербісол, Супер Ербісол, Екстра Ербісол) продукції цитокінів (ІЛ-1?, ІЛ-2, ІЛ-4, ІЛ-10, ФНП-? та ?-, ?-, ?-ІФ) у 15 здорових донорів (6 чоловіків та 9 жінок) дозволили проаналізувати 893 зразки супернатантів.
Продукція цитокінів клітинами хворих з ХССХ, в тому числі індукована препаратами Ербісолу, визначалась за даними 473 зразків супернатантів. Так, продукція ІЛ-1 спонтанна та індукована вивчалась у 10 здорових та 44 хворих на ХССХ, з додаванням Ербісолу - у 20 хворих; проведено аналіз 128 зразків за продукцією ІЛ-1 клітинами хворих. Продукція ?-ІФ спонтанна та індукована вивчалась у 10 здорових донорів та 44 хворих, з додаванням Ербісолу - у 19 хворих; тобто, проаналізовано 127 супернатантів. Продукція ІЛ-10 досліджувалась у 19 здорових донорів та 29 хворих, з додаванням Ербісолу - у 19 хворих; тобто було досліджено 115 супернатантів з активністю цього цитокіну. Синтез оксиду азоту (NO) спонтанний та індукований вивчався у 42 хворих, з додаванням Ербісолу у 19 хворих. Продукція NO клітинами здорових донорів вивчалась у 15 донорів, тобто досліджено та проаналізовано 167 зразків. Таким чином, спонтанна та індукована продукція цитокінів і оксиду азоту клітинами хворих з ХССХ проаналізована у 396 зразках супернатантів клітин хворих та з додаванням препаратів Ербісолу - в 77 зразках супернатантів пацієнтів. Всього досліджено 1366 зразків супернатантів клітин здорових та хворих на ХССХ. Також проаналізовано 825 показників імунітету 15 здорових донорів при культивації клітин за умов додавання Ербісолу, Супер та Екстра Ербісолу. Продукція цитокінів імунокомпетентними клітинами визначалась імуноферментним методом за допомогою тест-систем "DIACLONE" Франція на імуноферментному аналізаторі STAT FAX 303 PLUS.
2.2. Імуноферментний метод дослідження
а) Одержання супернатантів. Виділені на стандартному градієнті фікол -верографіну (1,076-1,078) мононуклеарні клітини периферійної крові відмивали тричі в середовищі 199 і ресуспензували в культуральному середовищі RPMI-1640, що містило 10% ембріональної телячої сироватки, 40 мкг/мл гентаміцину, 5х10 М 2-меркаптоетанолу та 3% L-глютаміну. Клітинну суспензію в концентрації 1,5х106 кл/мл інкубували 24 години в СО2-інкубаторі при t=37?С без стимулюючого агента, в присутності фітогемагглютиніну (ФГА) - 50 мкг/мл, ліпополісахариду (ЛПС) -30 мкг/мл та використовували різні розведення препаратів групи Ербісолів (Ербісолу, Супер Ербісолу та Екстра Ербісолу) - 1:100, 1:500, 1:1000 та 1:10 000. Розведення 1:100 відповідало разовій дозі препарату 2 мл в перерахунку на кількість клітин лімфоцитарно-моноцитарного ряду в 1 мл культурального середовища (на 1,5х106 кл/мл). По закінченні інкубації клітини осаджували центрифугуванням при 1600 об/хв протягом 10 хвилин, збирали супернатанти і зберігали до тестування при t= -20? С.
Вміст цитокінів у супернатантах визначали за допомогою імуноферментного методу. Для визначення вмісту цитокіну використовували тест систему "DIACLON", Франція.
Тестування проводилось за допомогою імуноферментного методу на приладі Stat Fax 303 Plus.
b) Визначення вмісту цитокіна у супернатантах. До 96-лункових планшет додавали: по 100 мкл стандартів в відповідні лунки для побудови калібровочної кривої. В інші лунки вносили по 100 мкл супернатанту, що досліджувався.
В усі лунки додавали по 50 мкл відповідних антицитокінових антитіл. Планшети інкубували при кімнатній температурі протягом 2 годин, потім лунки 5 разів ретельно промивали буфером і видаляли залишки рідини.
Далі в кожну лунку вносили по 100 мкл кон'югату (стрептовідін-пероксидазу), включаючи "нульову" пробу. Після цього проби інкубували при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Повторювали промивку планшети 5 разів та вносили до всіх лунок по 100 мкл TMB-субстрату (хромогену).
Після інкубації протягом 12-15 хвилин зупиняли ферментативно-субстратну реакцію, додаючи в кожну лунку по 100 мкл H2SO4.
Далі проводили визначення оптичної щільності стандартів та зразків супернатантів при довжині хвилі 450 нанометрів.
Для вірогідної оцінки результатів, калібрована стандартна крива при побудові повинна бути лінійною і вказувати на прямо пропорційний характер між рівнем концентрації цитокіну в супернатанті та оптичною щільністю. Дані аналізу проб щодо рівня синтезу цитокінів визначали шляхом їх інтерполяції з отриманою кривою.
Межі нормальних значень вказаних імунологічних параметрів були отримані на основі результатів дослідження умовно здорових 25 осіб відповідно до групи обстежених на ХССХ.
Математична обробка одержаних результатів проводилася за стандартними методиками варіаційної статистики з урахуванням розбіжностей за t критерієм Ст'юдента, яку оцінювали за допомогою показника довірчої ймовірності (р), меншого за 0,05 (Ласкін Г.Ф., 1980) за допомогою програм Statistica 5,0 for Windows.
Супернатанти, отримані вищевказанною методикою, використовувалися для тестування продукції цитокінів.
Під впливом імуномодуляторів групи Ербісол вивчались слідуючі ланки імунітету:
1) Моноцитарно-макрофагальної - по продукції ІЛ-1?, ФНП-?;
2) Т-хелперів I типу - за спонтанною і ст