РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИ
Робота виконана на базі лабораторії імуногенетики відділу медичної генетики (завідувач - д.м.н., проф. І.Р.Бариляк) Інституту експериментальної радіології (директор - д.м.н., проф. В.В.Талько) Наукового центру радіаційної медицини АМН України (генеральний директор - член-кор. АМН України, проф. В.Г. Бебешко).
2.1. Характеристика тварин, використаних в експерименті
Дослідження активності препаратів проводили в експерименті на 30 мишах лінії СВА. Використовували самців віком 6-8тижнів та масою біля 18-20 г. Мишей отримували з віварію Інституту гігієни та медичної екології АМН України.
2.2. Характеристика хворих, зразки крові яких використані при дослідженнях
Дослідження проводились in vitro із лейкоцитами 24 донорів крові, клітинами крові 21 постраждалого від аварії на ЧАЕС та такими 25 ВІЛ-інфікованих людей.
У вивченні групи людей, постраждалих від аварії на ЧАЕС, приймав участь лікар-імунолог Дарницького ТМО м.Києва Н.О.Петренко. Група людей, постраждалих від аварії на ЧАЕС, складалась із осіб, переважно жінок, 20-34 років, які були відселені з м. Прип'ять в 1986 році. Компонента дози отриманого зовнішнього опромінення, обумовлена перебуванням на території 30-кілометрової зони до моменту евакуації, складала 3-6,4 Бер. Всі обстежені з цієї групи страждали на часті респіраторні захворювання. Також, в групі визначалась захворюваність на вегето-судинну дистонію (92,5%), відмічались захворювання шлунково-кишкового тракту (92,5%) (хронічний гастродуоденіт, дискінезія жовчовивідних шляхів, хронічний холіцистит, холангіт), кардіоміопатії (38,1%), хронічний тонзиліт (47,6%), гіперплазія щитовидної залози (42,9%) та деякі інші захворювання. На період обстеження всі хворі знаходились в стані ремісії.
Дослідження хворих на ВІЛ-інфекцію виконані на базі Київського міського центру по профілактиці та боротьбі зі СНІДом і опортуністичними інфекціями КМКЛ №5 (головний лікар - В.Д.Юрченко). Група ВІЛ-інфікованих хворих складалася із осіб 20-30-річного віку, чоловіків та жінок. Для дослідження відбирали зразки крові хворих в стадії СНІД-асоційованого комплексу.
2.3. Методи досліджень
Для отримання препаратів використовували тимус телят. При фракціонуванні екстрактів використовували такі маніпуляції як гомогенізація, центрифугування, висолювання сульфатом амонію, осадження органічними розчинниками, нагрівання та діаліз. Концентрацію білку визначали методом Лоурі ?290?.
Для формування уявлення про особливості дії тимосоміну його активність порівнювали із впливом ліпосомного препарату ліпіну ("Біолік") в концентрації 0,175 мг/мл (за перерахунком з рекомендованої дози) та розчинного препарату гормонів тимусу тималіну ("Біофарма") в концентрації, яка відповідала концентрації білку в тимосоміні.
Відповідно до завдань дослідження для характеристики отриманих препаратів були застосовані біохімічні та фізико-хімічні, імунологічні та статистичні методи.
1. Електрофорез у поліакриламідному гелі
Електрофорез у поліакриламідноиу гелі з використанням додецилсульфату натрію дозволяє фракціонувати білки в залежності від їх відносної молекулярної маси. За рахунок гідрофобних взаємодій детергент приблизно однаково зв?язується з переважаючою більшістю білків. Величезний надлишок повністю дисоційованих залишків сульфокислоти, що привносяться детергентом, у більшості випадків робить несуттєвою роль власного заряду білка ?290, 291?.
Електрофорез проводили у 5%-му концентруючому та 20%-му розділяючому поліакриламідному гелі, що містив 0,1% додецилсульфату натрію. Буфер: трис-HCl, рН 8,9. Барвник: кумасі синій G-250. В якості маркерів молекулярної маси використовували: альбумін сироватки великої рогатої худоби (66 кД), яєчний альбумін (43 кД), карбоксилазу (30 кД) і лактоальбумін (14,2 кД) ("Sigma").
2.Тонкошарова хроматографія
Хроматографічне розділення - це процес, при якому компоненти суміші, що розділяється, розподіляються між двома фазами, які не змішуються. Одна з фаз нерухома (стаціонарна), а інша - рухома (мобільна), звичайно вона тече по нерухомій фазі або пропускається через неї. Тонкошарова хроматографія протікає в тонкому шарі сорбенту, при чому товщина шару набагато менша за його ширину. Змінюючи полярність системи розчинників можна перемістити досліджувану суміш в зону оптимального розподілення. Серед аналітичних методів, що використовуються в дослідженнях ліпідів, тонкошарова хроматографія займає одне з перших місць ?292?.
Для виділення та аналізу ліпідної частини тимосомін випаровували насухо, розчиняли в ацетоні та аналізували методом тонкошарової хроматографії на пластинках "Silufol". Після нанесення зразка хроматограму поміщали в суміш розчинників петролейний ефір - діетиловий ефір - оцтова кислота (90:10:1). Для більш детального розділення фосфоліпідів проводили тонкошарову хроматографію препарату послідовно в двох системах розчинників: елюювали в системі хлороформ - метанол - вода - n-гептан (65:25:4:9), а після просушування при кімнатній температурі - в системі n-гептан - етиловий ефір - оцтова кислота (95:4:1). Для виявлення просушену хроматограму обробляли 10% розчином фосфомолібденової кислоти в 96%-му етанолі та нагрівали до 80-900С, після чого зони ліпідів забарвлюються в темно-синій колір на жовто-зеленому фоні.
3. Визначення діаметру та концентрації ліпосом методом спектру мутності
Визначення діаметру та концентрації ліпосом в препараті проводили за допомогою методу спектру мутності ?293?. Метод базується на основі теорії розсіювання світла малими частинками. Плавний характер спектра мутності ?=?(?) в невеликому інтервалі ?? дозволяє апроксимувати спектр мутності співвідношенням Ангстрема:
???-n, де(2.1)n - хвильовий експонент, який може бути визначений з графіка залежності lgD від lg?.
Для цього визначається оптична густина досліджуваної суспензії при різних довжинах хвиль від 400 до 600 нм. Графік має форму прямої.