РОЗДІЛ 2
Матеріали і методи ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Об”єкти дослідження (клітинні лінії та лейкоцити периферичної крові)
Для дослідження проліферативної активності лімфоцитів під впливом ФНП,
експресії рецепторів ФНП обох типів та стимуляції поверхневої експресії молекул
адгезії було використано лейкоцити периферичної крові. Також для дослідження
проліферативної активності ФНП, експресії рецепторів ФНП обох типів було
використано лінію людської Т-клітинної лейкемії Jurkat. Для визначення
цитотоксичної активності ФНП було використано лінію мишиної фібросаркоми L929
(класичний біотест для визначення функціональної активності ФНП).
Лінію мишиної фібросаркоми L929 і лінію людської Т-клітинної лейкемії Jurkat
отримали із клітинної колекції Інституту цитології РАН (Санкт-Петербург,
Росія). Зразки гепаринізованої периферичної крові отримали від 12 постійних
здорових донорів з Київської міської станції переливання крові. Щоб усунути
вплив ендогенних жіночих стероїдних гормонів, використовували зразки крові
тільки від донорів-чоловіків.
Для культивування клітин ліній L929, Jurkat і лейкоцитів периферичної крові
використовували середовище RPMI-1640 без фенолового-червоного з додаванням
бікарбонату натрію, L-глутаміну, 40 мкг/мл гентаміцину та 10 % діалізованої ЕТС
(“BioMark, Inc.”, Україна) (RF10). Фетальну сироватку діалізували проти
20-разового надлишку ФСБ протягом 5 діб при 40С з 5-разовою зміною діалізного
розчину (проникність діалізної мембрани для речовин з м.м. 10 кДа). Після
діалізу вміст жіночих стероїдних гормонів становив менше ніж 1 нг/мл.
Клітини лінії L929 підтримували у log фазі росту через пасаж кожні 3 - 4 доби.
Для зняття клітин з поверхні пластика використовували Версен (ФСБ-ЕДТА).
Клітини лінії Jurkat підтримували у log фазі росту через пасаж кожні 3 - 4
доби.
2.2. Матеріали, використані під час дослідження (цитокіни, гормони та інші
реагенти)
Рекомбінантний препарат ФНП людини (1мг/мл у ФСБ) отримали від НВО “Вектор”
(Бердськ, Росія). Рекомбінантні препарати ІЛ-1a, ІЛ-b були люб’язно надані О.С.
Сімбірцевим (НДІ особливо чистих препаратів РАН, Санкт-Петербург, Росія).
Нейтралізуючі мАт F74 проти ФНП (нейтралізуюча активність 42.8ґ104/мг), мАт
проти ФНП 5Е12 та 1G10 були отримані в лабораторії [5,196]. Професором Wallach
D. (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel) були люб’язно надані мАт
проти ФНПР1 (mAb№20) та ФНПР2 (mAb№13). Водорозчинні препарати жіночих
стероїдних гормонів прогестерону та 17b-естрадіолу отримано від “Sigma Chemical
Co.”, St. Louis, MI, USA.
У всіх експериментах, якщо це не оговорено окремо, використовували прогестерон
у концентрації 2 мкг/мл і 17b-естрадіол у концентрації 0.2 мкг/мл. У першому
триместрі вагітності в периферичній крові концентрація прогестерону становить у
середньому 15-20 нг/мл, а естрогену - 2 нг/мл. Локально (в плаценті та
тканинах, що її оточують) концентрація гормонів перевищує такі в периферичній
крові більше, ніж у 100 разів [98,129,152,172]. Тому концентрації жіночих
стероїдних гормонів були обрані з урахуванням їх локальної продукції в системі
мати - плід під час вагітності.
Усі імунохімічні реагенти, гормони, а також культуральні середовища, якщо це не
оговорено окремо, отримано від “Sigma Chemical Co.”, St. Louis, MI, USA.
2.3. Обладнання
Для роботи з клітинними лініями та лейкоцитами периферичної крові
використовували ламінарні шафи (“Kojair”, Finland), СО2-інкубатор (“Revco
Scientific Instruments”, NC, USA), інвертований мікроскоп (“ЛОМО”,
Санкт-Петербург, Росія), та сосуди Дюара (“Темед”, Харків) для зберігання
клітин у рідкому азоті. Для роботи з клітинами використовували обладнання фірми
“Labsystem Oy” (Helsinki, Finland) ІФА-рідер Multiscan MCC/340 та автоматичні
піпетки. Включення радіоактивної мітки 3Н-тимідину вимірювали на
спеціалізованому обладнанні Betaplate Workstation фірми “Wallac Oy” (Betaplate
b-лічильник, клітинний харвестер (“Skatron”, Norway), касети для вимірювання,
скловолоконні фільтри “Filtermat”, сцинтиляційна рідина “Betascint”, пластикові
пакети та допоміжне обладнання для приготування касет). Проточна флуориметрія
виконувалася на приладі FACScan (“Becton-Dickinson Immunocytometry Systems”,
San Jose, CA, USA). Для обробки та представлення результатів використовувался
комп’ютер з операційною системою Microsoft Windows SE і прикладними програмами
Microsoft Word 98, Microsoft Excel 2000 (“Microsoft Corporation”, USA) та
GraphPad InStat., 2000 (“GraphPad Software Inc.”, USA).
2.4. Проліферативна активність лімфоцитів периферичної крові
Для оцінки проліферативної активності лімфоцитів суспензію мононуклеарних
клітин периферичної крові (5Ч104 клітин/лунку), виділених за допомогою
градієнта щільності Ficoll-Paque (“Pharmacia”, Швеція), а також анти-CD3 Ат
(“CLB”, Нідерланди) в кінцевій концентрації 150 нг/мл, розчини цитокінів: ФНП,
ІЛ-1a або ІЛ-1b у кінцевій концентрації 0, 0.1, 0.5 нг/мл і 2.5 нг/мл; та
прогестерон, 17b-естрадіол, чи їх комбінацію вносили в круглодонні 96-луночні
планшети (“Falcon”, США). Контрольні лунки містили тільки анти-CD3 стимульовані
лімфоцити або відповідні концентрації гормонів. Усі розчини готували на
середовищі RF10. Планшети інкубували 72 год при 370С у СО2-інкубаторі. Через 48
год. інкубування збиралися зразки супернатантів від культури мононуклеарних
клітин з метою визначення ФНП. Зразки зберігалися в замороженому стані при
–200С. Проліферацію оцінювали за включенням 3Н-метил-тимідину, який додавали по
0.5 мкКи/лунку через 48 год після початку інкубації на 24 год. Збір і
вимірювання зразків здійснювали за допомогою приладу “BETAPLATE workstation”.
Для оці
- Київ+380960830922