розділ 2
МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Для розв’язання завдань та досягнення мети, поставлених в роботі, проведено
імунологічне дослідження 199 зразків крові (в динаміці обстеження) від 58
вагітних жінок із звичним невиношуванням вагітності нез’ясованої етіології
(ЗНВ) та 45 зразків крові від 42 соматично здорових вагітних жінок з
необтяженим акушерсько-гінекологічним анамнезом і фізіологічним перебігом
вагітності. Загальна характеристика та обсяг дослідженого в роботі матеріалу
наведені у додатку А (табл. А.1).
Матеріалом дослідження були лімфоцити цільної периферичної (венозної) крові,
виділені мононуклеарні клітини та сироватка крові. Зразки крові забирали в
стерильні флакони з 0,1 мл 5 % розчину гепароїда (Spofa, Чехія) для дослідження
лімфоцитів крові і виділення мононуклеарних клітин та в сухі скляні пробірки
для отримання сироватки. В зразках цільної крові проводили визначення
субпопуляції лімфоцитів та експресії на них маркеру активації HLA-DR (CD3+,
CD19+, CD16/56+, CD3+4+, CD3+8+, CD4+45RA+, CD3+DR+, CD4+DR+, CD8+DR+). На
виділених мононуклеарних клітинах крові здійснювали типування за антигенами
гістосумісності І класу, дослідження функціональної активності ConА-індукованих
лімфоцитів і експресії маркеру активації CD25 (CD3+25+, CD4+25+, CD8+25+,
CD16/56+25+). У сироватках крові визначали антифосфоліпідні антитіла (АФА) та
концентрацію плацентарних протеїнів – хоріонічного гонадотропіну (ХГ) та
глікоделіну.
У роботі також проведено дослідження зразків крові від 36 чоловіків обстежених
жінок та 6 донорів (додаток А, табл. А.2), на мононуклеарних клітинах яких
проводили типування за антигенами гістосумісності І класу з метою оптимізації
вибору донора для алоімунізації.
2.1. Методи імунологічного обстеження
2.1.1.Визначення антифосфоліпідних антитіл (АФА). АФА класу IgG визначали в
сироватці крові вагітних жінок імуноферментним аналізом з використанням
комерційного набору реагентів ANTI-CARDIOLIPIN (Sigma, США) та обладнання для
проведення аналізу – планшетного промивача та планшетного фотометра
(Labsystems, Швеція), – згідно з інструкцією, що додається до набору реагентів.
Результат виражали як позитивний (АФА в крові наявні) або негативний (АФА
відсутні).
2.1.2. Типування за антигенами HLA-комплексу. Визначення антигенів HLA
проводилося в комплемент-залежному цитотоксичному тесті [269] з використанням
панелі антисироваток для типування (Российский центр иммунологического
типирования тканей, Росія), що містила сироватки для визначення 14 антигенів
локусу А, 22 антигенів локусу В та 5 антигенів локусу С. Антисироватки вносили
в лунки мікропланшетів для типування під вазелінову олію, в краплини з
антисироватками вносили по 1 мкл суспензії мононуклеарних клітин, попередньо
виділених за традиційною методикою центрифугування на градієнті щільності,
інкубували 30 хв. за кімнатної температури, додавали по 5 мкл кролячого
комплементу і знову інкубували 1 год. З лунок планшету струшуванням видаляли
вазелінову олію, в кожну лунку вносили по 1 мкл барвника трипановий синій,
інкубували 10 хв. при 370С, потім видаляли барвник з лунок. Цитотоксичну
реакцію в лунках, що свідчила про наявність відповідного HLA-антигену,
враховували при світловій мікроскопії вмісту лунок з урахуванням кількості
пофарбованих (мертвих) клітин. Результат виводили як HLA-фенотип лімфоцитів.
Визначаючи збіг за HLA-антигенами в парах жінка-чоловік або жінка-донор,
враховували як ідентичні, так і перехресно-реагуючі антигени.
2.1.3. Визначення субпопуляцій лімфоцитів периферичної крові та експресії
маркерів активації на лімфоцитах. Визначення поверхневого фенотипу лімфоцитів
крові здійснювали за методом двокольорової проточної цитофлуориметрії з
використанням моноклональних антитіл (Becton Dickinson, США), мічених
флюоресцеїн-ізотіоціонатом (FITC) та фікоерітрином (PE). Перелік реагентів
моноклональних антитіл, які були використані в роботі, наведений в табл. 2.1.
Таблиця 2.1
Перелік реагентів моноклональних антитіл, використаних для визначення
поверхневого фенотипу лімфоцитів
Реагенти моноклональних антитіл
Фенотип, що визначається
Субпопуляція лімфоцитів
LeucoGATE
СD45+, CD14+
Лейкогейт
g1 FITC + g2 PE
Контроль
Нефарбовані клітини
CD3 FITC + CD19 PE
CD3+
CD19+
T-лімфоцити,
В-лімфоцити
CD3 FITC + CD4 PE
СD3+4+
T-хелпери
CD3 FITC + CD8 PE
СD3–8+
СD3+8+
Природні кілери
T-цитотоксики
CD3 FITC + CD16+56 PE
CD3–CD16/56+
Природні кілери
CD3 FITC + Anti-HLA-DR PE
СD3+DR+
Активовані T-лімфоцити
CD3 FITC + Anti-IL2R PE
СD3+25+
CD4 FITC + Anti-HLA-DR PE
СD4+DR+
Активовані хелперні лімфоцити
CD4 FITC + Anti-IL2R PE
СD4+25+
CD8 FITC + Anti-HLA-DR PE
СD8+DR+
Активовані цитотоксичні лімфоцити
CD8 FITC + Anti-IL2R PE
СD8+25+
Anti-IL2R FITC + CD16+56 PE
СD16/56+25+
Активовані природні кілери
Зразки цільної крові у об’ємі 50 мкл розміщували у полістіролові пробірки
(Falcon, США), до зразків крові додавали відповідні реагенти моноклональних
антитіл у об’ємі 10 мкл. Кров ретельно перемішували з реагентами за рахунок
струшування на приладі Minigen, пробірки розміщували у темряві та інкубували за
кімнатної температури протягом 30 хв. Після закінчення інкубації в кожну
пробірку додавали по 1 мл лізуючого розчину Lising Solution (Becton Dickinson,
США) для лізису еритроцитів, струшували на приладі Minigen, після чого залишали
пробірки за кімнатної температури на 10 хв. Після цього двічі відмивали клітини
крові у надлишку поліфосфатного буферу шляхом центрифугування 5 хв. при 200g.
Надосад після другого центрифугування видаляли, додавали в кожну пробірку по
500 мкл поліфосфатного буферу, з
- Київ+380960830922