РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Фізико-хімічні характеристики вуглецевих матриць та ДНК
Для іммобілізації ДНК використовувалися високодисперсні, волокнисті та
високопористі гранульовані вуглецеві адсорбенти.
Високодисперсний вуглецевий сорбент марки Norit A Supra являв собою порошок
чорного кольору з розміром частинок 10-25 мкм і насипною масою 0,295 г/см3.
Волокнисті вуглецеві сорбенти марки АУВМ використовувалися 2 типів: 1 –
мікроволокна з розміром 8x7x50 мкм і насипною масою 0,223 г/см3 та 2 – волокна
довжиною 4-7 мм і насипною масою 0,07-0,09 г/см3.
Високопористі вуглецеві гранульовані сорбенти марки ГСГД мали насипну масу від
0,06 до 0,19 г/см3.
Для порівняння сорбційних властивостей застосовувалися також сорбенти марки СКН
з насипною масою 0,4 г/см3 та AdsorbaТ (“Gambra Medical”, Швеція) з насипною
масою 0,51 г/см3.
Для іммобілізації використовувалася нативна ДНК з тимусу телят (нДНК) фірми
“Sigma” (США) з молекулярною масою 9 млн. Дальтон. Денатуровану ДНК (дДНК)
отримували шляхом нагрівання нативної ДНК до 1000 С протягом 30 хвилин в
присутності формальдегіду з подальшим її швидким охолодженням на льоду, або
використовували дДНК фірми “Sigma” (США). В окремих дослідах для порівняння
властивостей ДНК в залежності від джерела їх одержання для іммобілізації
застосовувалася ДНК з молочок оселедця (“Sigma”, США).
2.2. Оцінка ефективності зв’язування ДНК з вуглецевою матрицею
Ефективність іммобілізаціі ліганду оцінювали за десорбцією ДНК із дослідних
зразків у надосадову рідину після їх інкубації з фізіологічним розчином або
дистильованою водою при струшуванні протягом 6 годин. Проби, які містили
імуносорбенти на основі високодисперсних і волокнистих вуглецевих матриць,
центрифугували при 3 - 8 тисяч об./хв. протягом 15-20 хвилин. та пропускали
через фільтри Millipore 0,45 (“Millipore Corp.”, США). Вміст ДНК в надосадовій
рідині визначали за методом Спіріна А.С. [31].
2.3. Методи визначення ДНК-зв’язуючої активності сироватки та плазми крові
Обстежено 163 хворого на аутоімунні захворювання та 14 хворих пострадіаційною
нейросоматичною поліпатією віком від 25 до 65 років. Серед хворих на
імунозалежні захворювання було: 93 особи з СЧВ, 13 – з псоріазом, 30 – з
псоріатичною артропатією, 10 – з ревматоїдним артритом, 15 – з хронічним
аутоімунним гепатитом. Діагнози хворих визначені на основі комплексу клінічних
та лабораторних критеріїв (Додаток А). Контрольна група – аналогічна основним
за віком та статтю – становила 22 клінічно здорових донорів. Забір крові хворих
та здорових донорів проводився в Міському ревматологічному центрі на базі
Центральної клінічної лікарні м.Києва (завідувач – к.мед.н. Тер-Вартяньян
С.Х.), в Київському центрі хірургії печінки, жовчних проток та підшлункової
залози при кафедрі загальної хірургії №1 Національного медичного університету
ім. О.О.Богомольця (завідувач кафедрою до 2002 р. – д.мед.н., професор Земсков
В.С., з 2003 р. – д.мед.н., професор Дронов О.І.), в Центральній районній
клінічній лікарні №12 м.Києва (керівник ортопедичного центру ендопротезування,
хірургії та реабілітації – к.мед.н. Косяков О.М.) та у Військово-медичному
управлінні СБ України начальник відділення гемосорбції і плазмаферезу Скляренко
В.Г.).
Рівень антитіл проти нДНК, дДНК та ДНК-протеїнового комплексу (ДНП) в
сироватці або плазмі крові хворих та донорів визначали методом твердофазного
неконкурентного імуноферментного аналізу [ 34, 35, 77, 142] у власній
модифікації.
На полістироловому круглодонному планшеті (“Microtiter”, Великобританія)
адсорбували антиген нДНК (“Sigma”, США) або дДНК (“Sigma”, США) з водного
розчину концентрації 1 мкг/мл, а ДНП, наданий професором Cebecauer L. (Research
Institute of Rheumatic Diseases, м.П’єштани, Словаччина), з буферного розчину
концентрації 10 мкг/мл. В лунки планшетів вносили по 200 мкл розчинів нДНК або
дДНК, висушували в термостаті при температурі 56-600С протягом 12-24 годин.
Після внесення в лунки по 200 мкл 960 етилового спирту проводили
ультрафіолетове опромінення планшетів ртутно-кварцевим настільним опромінювачем
ОКН-11 протягом 15-20 хвилин. Для одержання планшетів з іммобілізованим ДНП в
лунки вносили по 200 мкл розчину ДНП та інкубували при кімнатній температурі
протягом 60 хвилин.
Досліджувані сироватки або плазму розводили 0,2% розчином сироваткового
альбуміну людини (HSA, “Sigma”, США) або бика (BSA, “Sigma”, США) в
стандартному фосфатному буфері з 0,05% Tween 20 (“Sigma”, США). В лунки
планшету вносили по 200 мкл сироваток або плазми крові відповідного ступеню
розведення (в 100, 200, 400 разів). Планшети витримували 30 хв. при температурі
370С. Після промивання їх розчином фосфатного буфера в лунки вносили по 200 мкл
розчину кролячих моноклональних антитіл проти IgG людини, кон’югованих з
пероксидазою хрону (“Sigma”, США), в робочому розведенні 1:40000 і витримували
30 хв. при температурі 370С. Як субстрат реакції використо- вували
ортофенілендіамін (“Sigma”, США) з додаванням ex tempore 3% розчину перекису
водню. Стоп-реагентом був 0,5 моль/л розчин сірчаної кислоти. Оптичну густину
вимірювали при довжині хвилі 492 нм на спектрофотометрі “SLT- Labinstruments”
(Австрія). Результати аналізів подавали у величинах екстинкції.
2.4. Оцінка неспецифічних та специфічних властивостей синтезованих
імуносорбентів
Неспецифічні поглинальні властивості адсорбентів вивчали в експериментах по
кінетиці адсорбції маркерних сполук – з буферного розчину креатиніну (113 Да)
та водного розчину вітаміну В12 (1355 Да) [3] . Початкові концентрації були:
для креатиніну – 0,3