РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Методи експериментального моделювання
а) Методика отримання потомства щурів
Згідно мети дослідження, до експерименту були залучені статевозрілі тварини, а також 1-місячні щурята, тому одним з методів дослідження стало отримання потомства експериментальних тварин. Для розведення відбирали статевозрілих щурів лінії Вістар, що утримувалися на стандартному раціоні віварію Одеського державного медичного університету. Фертильного періоду самки досягали у 3-4-місячному віці, а самці дещо пізніше. На одного самця відводили 5 самок. Тривалість вагітності щурів 20-26 днів. Видимі ознаки вагітності відмічаються з другого тижня. Самка в одному пометі приносить 6-10 щурят, а за рік буває 5-9 пометів. Таким чином, самець та самка протягом року лишають потомство, що нараховує 40 і більше щурят.
Для отримання потомства від опромінених тварин в умовах віварію до 2 опромінених самців у віці 4-5 місяців підсаджували 10 самок того ж віку, опромінених у тій же дозі. Вагітні самки відбиралися кожен день вранці на основі аналізу піхвенних мазків та розсаджувалися у індивідуальні клітки для пологів [68]. У день пологів перераховували кількість народжених щурят у кожної самки, через місяць - кількість щурят, що досягли 1-місячного віку, визначали загальні аномалії розвитку. У 1-місячному віці щурята були взяті до експерименту з використанням методик, що проводилися у дорослих тварин. Контролем служили неопромінені щурі та щурята, що народилися від них.
б) Метод фізичного навантаження тварин
Моделювання фізичного навантаження здійснювалось шляхом плавання тварин при температурі води 25 - 260С у посуді з тягарем, маса якого становила 10% від маси піддослідних тварин.
в) Метод опромінення тварин та отримання матеріалу
Для проведення експерименту статевозрілі щури були піддані тотальному одноразовому гама-опроміненню 60Со вранці натщесерце на установці для телегаматерапії "Агат", відстань до джерела поглинання 75 см, потужність дози 0,54 Гр/хв, поглинута доза 0,5 Гр; 1,0 Гр; 3,0 Гр. Для опромінення тварини були поміщені у спеціальну камеру із органічного скла з розмірами 20 х 20 х 6 см, розділену перегородками відповідно розмірам тварин.
Біостатус тварин оцінювали за зміною рухливості, відношенням до їжі, рефлексу охайності, стану шерсті, слизових оболонок, шлунково-кишкового тракту. Тварин спарювали протягом 10 діб після опромінення. Утримання вагітних самок у обмінних клітках дозволяло вести за ними постійний нагляд.
Враховуючи, що кількість живих 1-місячних щурят, отриманих від одної самки, є одним із критеріїв життєздатності потомства, оскільки у ньому не тільки результуються зміни, що відбуваються у ранньому постнатальному періоді онтогенезу, але й характеризується здатність тварин до самостійного життя, у щурят у цьому віці виявляли радіорезистентність, для чого піддавали їх тотальному одноразовому гама-опроміненню у дозі 1,0 Гр. Умови опромінення такі ж, як і у статевозрілих тварин. Контролем були щурята, народжені від інтактних тварин. Дозиметричний контроль проводився дозиметричною службою Одеського обласного онкологічного діспансеру, на базі якого здійснювалося опромінення тварин.
Таким чином, було створено 12 експериментальних груп. Враховуючи умови експерименту (отримання потомства опромінених тварин, а також забій статевозрілих тварин через 1 добу після опромінення, летальність потомства опромінених тварин, отримання певної кількості 1-місячних щурят від інтактних та опромінених у різних дозах тварин для вивчення метаболізму креатину, забій 1-місячних щурят через 1 добу після опромінення у дозі 1,0 Гр, а також вивчення радіорезистентності щурят), дослідження були проведені на 120 статевозрілих щурах масою 180-220 г та 210 1-місячних щурятах масою 38-42 г.
1. Інтактні статевозрілі тварини
2. Статевозрілі тварини, опромінені у дозі 0,5 Гр
3. Статевозрілі тварини, опромінені у дозі 1,0 Гр
4. Статевозрілі тварини, опромінені у дозі 3,0 Гр
5. 1-місячні щурята, отримані від інтактних тварин
6. 1-місячні щурята, отримані від тварин, опромінених у дозі 0,5 Гр
7. 1-місячні щурята, отримані від тварин, опромінених у дозі 1,0 Гр
8. 1-місячні щурята, отримані від тварин, опромінених у дозі 3,0 Гр
9. 1-місячні щурята, отримані від інтактних тварин, яких піддали фізичному навантаженню
10. 1-місячні щурята, отримані від опромінених у дозі 0,5 Гр тварин, яких піддали фізичному навантаженню
11. 1-місячні щурята, отримані від опромінених у дозі 1,0 Гр тварин, яких піддали фізичному навантаженню
12. 1-місячні щурята, отримані від опромінених у дозі 3,0 Гр тварин, яких піддали фізичному навантаженню
Після декапітації тварин під ефірним наркозом вилучалася передня група м'язів стегна, серце, печінка, нирка, збиралася кров. Для виявлення вмісту метаболітів (креатину, амінокислот, аденілових нуклеотидів) тканини занурювали у рідкий азот, для виявлення активності ферментів та ізоферментного спектру тканини гомогенізували у трис-сахарозному середовищі рН 7,4 та піддавали диференційному центрифугуванню [165].
2.2. Методи досліджень вмісту метаболітів та активності ферментів у тканинах
а) визначення вмісту гліцину, глікоциаміну та аргініну, креатину та
креатиніну, аденілових нуклеотидів у тканинах. Однією з ініціюючих ланок реакції організму на дію іонізуючої радіації є ушкодження креатинутворюючої системи, що знаходить свій прояв у порушенні адекватного енергозабезпечення клітин життєвоважливих органів і тканин. Синтез креатину в організмі залежить від наявності аргініну, що, як незамінна (есенціальна) амінокислота, надходить до організму тільки екзогенно, з їжею. Це визначає роль травної системи у постачанні матеріалу для синтезу компонентів креатинутворюючої системи. Окрім цього, травна система однією з перших реагує на опромінення [82; 186]. Аргінін - єдиний донатор гуанідинової групи-є потужним стимулятором синтезу креатину, бере активну у
- Київ+380960830922