Клітинна селекція пшениці на стійкість до Fusarium graminearum Schwabe.

<p>Розділ 2<br />МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИка проведення досліджень<br />Загальні принципи роботи з культурами тканин рослин in vitro викладені в<br />монографіях Бутенко [17] і Калініна з співавт. [47]. <br />2.1. Рослинний матеріал та культуральні процедури<br />В роботі використовували сорти озимої м’якої пшениці Trіtіcum aestіvum L.:<br />стійкі до Fusarium graminearum Nobeoka bozu komugi (Японія), Са 8055, 80117<br />(Китай) та Даха (РФ), середньо­вразливий сорт Arcole (Франція), ураз­ливі<br />Миронівська 808, Донська напівкарликова, Миронівська 61, а також сорти<br />Миронівська 29, Миронівська 33, Одеська напівкарликова, Fakta (Німеччина),<br />Co 7250-5 (США), Balkan (Югославія), Roazon (Франція). Рослини вирощували в<br />оранжереї та кліматичних камерах в умовах фітотрону згідно з рекомендаціями<br />Шаліна з співавторами [120] або в польових умовах. <br />Стерилізацію незрілих зернівок проводили за такою схемою: 70о спирт — 3 хв,<br />насичений розчин хлораміну — 5-6 хв; 0,01 н HCl — 3 хв, дистильована вода —<br />тричі по 3 хв. Розчин соляної кислоти і воду попередньо автоклавували 20 хв.<br />Для ініціації калюсних культур незрілі зародки в асептичних умовах ізолювали з<br />допомогою пінцета і гострої лопатки під бінокуляром чи без нього і переносили<br />на відповідне агаризоване середовище щитком угору по 20-30 шт. на чашку Петрі.<br />Незрілі зародки диференціювали за розмірами 0,25-0,5 мм, 0,5-0,75 мм, 0,75-1<br />мм, 1-1,25 мм, 1,25-1,5 мм, 1,5-2 мм і більше 2 мм. Для ініціації та росту<br />калюсів використовували середовища MS [239], SD [270], B5 [183], T [174], з<br />добавкою 2,4-Д (1-2 мг/л чи більше, залежно від варіанту). Прописи середовищ<br />наведені в таблиці А.1. <br />На кожен варіант досліду висаджували не менше 100 зародків. Повторність досліду<br />дво- чи триразова. Культивування до регенерації проводили в темряві при 25 oС,<br />період субкультивування складав при використанні різних середовищ 3 тижні, при<br />вивченні впливу тривалості субкультурального періоду на середовищах MS та SD —<br />2, 4 та 6 тижнів. При пересадці калюсів вміст 2,4-Д зменшували на 0,5 мг/л.<br />Регенерацію індукували пасажем на безгормональне середо­вище. У процесі<br />культивування оцінювали частоту калюсогенезу, часто­ту появи ембріогенних<br />калюсів, частоту регенерації. Через 5-6 тижнів культивування на<br />безгормональному середовищі рослинки пересаджували для приживлення в посудини<br />зі стерильним ґрунтом, яровизували і вирощували до стиглості у камерах штучного<br />клімату. Використовували також спосіб яровизації рослинок-регене­рантів у<br />колбах на середовищі для регенерації. Яровизацію проводили при +2...+4оС у<br />камерах штучного клімату. <br />Після висадження регенерантів у ґрунт і яровизації, насіння першого покоління<br />регенерантів R1 отримували в камерах штучного клімату шляхом примусового<br />самозапилення. Потомство кожного колоса було висіяне у полі для отримання R2 і<br />оцінки частоти сомакло­нальної мінливості. В R2 оцінювали частоту появи<br />морфологічно зміне­них форм у кожному варіанті досліду, успадкування змін<br />перевіряли в R3 по сім’ях. Обробку результатів проводили методами<br />багато­фактор­ного дисперсійного аналізу після перетворення процентів в<br />arcsіnЦp. <br />2.2. Культивування грибних патогенів та отримання КФ<br />Культури Fusarіum gramіnearum Schwabe (F.g.) та Fusarium culmorum (W.G. Smith)<br />Sacc. отримували за стандартними методиками [14]. <br />Ідентифікацію збудників фузаріозу колоса здійснювали за системою Білай [14] на<br />сусло-агаровому та картопляно-глюкозному агаризованому (КГА) середовищі за<br />морфолого-культуральними ознаками: колір і характер росту міцелію, колір<br />строми. Остаточне визначення виду проводили при мікроскопічному дослідженні<br />об’єктів з урахуванням морфологічних особливостей та розмірів мікроконідій. <br />З колекції ізолятів патогенів виділяли моноспорові штами, які були протестовані<br />на утворення фітотоксичних речовин та на стійкість до фунгіцидів на КГА з<br />додаванням фунгіцидів. У подальшій роботі викори­стовували найбільш стійкі до<br />фунгіцидів і водночас найбільш агресивні у сенсі токсиноутворення ізоляти. <br />Чисті культури патогенів переносили в рідке середовище на основі картопляного<br />екстракту і глюкози чи сахарози з додаванням вітамінів і культивували на<br />шейкері при 25oС. Після 3-5 тижнів культивування, коли токсичність фільтрату<br />була максимальною, культу­ральну рідину відокремлювали від міцелію<br />центрифугуванням, очищали послідовним пропусканням через фільтри (розмір пор до<br />1,2 мкм) і стерилізували через фільтри 0,45 та 0,22 мкм. Готували також<br />концен­т­рат культурального фільтрату (КФ) патогенів шляхом випа­рювання на<br />ро­тор­ному випарювачі при 45оС в 100 разів, який після фільтру­вання<br />сте­рильно розфасовували по 1-5 мл і зберігали до викори­стання в морозильній<br />камері. Культуральні фільтрати додавали в середовища після автоклавування в<br />діапазоні концентрацій від 0 % до 50 % (об/об, V/V). <br />2.3. Процедури оцінки та добору стійких ліній пшениці <br />Кокультивування калюсів та живих патогенів. Спільне культивування калюсів та<br />живих патогенів проводили після пересадки калюсів на свіже середовище. Поміщали<br />по 10 калюсів по периметру чашки, а в центр чашки інокулювали культуру<br />патогена. Через кожну добу культи­вування фіксували діаметр колонії патогена та<br />візуально оціню­вали стан калюсних культур аж до їх повної колонізації<br />патогеном і вира­жених ознак загибелі. <br />Вплив КФ на калюсогенез. Для ініціації та росту калюсів використовували<br />середовище MS з добавкою КФ. На кожен варіант досліду висаджували по 100<br />зародків. Повторність досліду дворазова. Культивування проводили аналогічно<br />описаному вище. У процесі куль­ти­вування оцінювали частоту калюсогенезу,<br />зовнішній стан експлантів, часто­ту появи ембріогенних зо</p>