РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Враховуючи мету і завдання поставлені в дисертаційній роботі, а також сучасні
уявлення про механізми радіаційних уражень організму та шляхи можливої корекції
радіоіндукованих ефектів у клітинах, нами вибрано наступний методологічний
підхід та комплекс лабораторних методів дослідження.
2.1. Підготовка рослинного матеріалу та умови дослідження
Для дослідів використовували гібриди кукурудзи Піонер 3978 і БМ281. Гібрид
Піонер 3978 – простий міжлінійний гібрид, отриманий шляхом схрещування
самозапилених ліній (Л. 346 – материнська, л. 502 – батьківська форми). Гібрид
БМ281 створений шляхом схрещування сестринського гібриду Оксана та лінії УЧ52.
Занесений до Реєстру сортів рослин України і допущений до використання по зонах
Лісостепу і Степу України на зерно і силос, авторське свідоцтво № 499
(Буковинський інститут АПК Української академії аграрних наук). Взяті для
дослідження гібриди відзначаються широким розповсюдженням і використанням,
мають ряд біологічних особливостей, які роблять їх зручними для дослідження.
Насіння кукурудзи відмивали водою, замочували в розчинах вітамінів С (1 мг/мл)
і РР (0,5 мг/мл) та їх суміші протягом 24 годин, далі розкладали в чашки Петрі
або емальовані кювети по 50 штук в кожну на фільтрувальний папір. Вибір
вказаних вище концентрацій вітамінів для обробки насіння був зроблений на
підставі вивчення їх впливу на проростання в лабораторних умовах, а також
літературних даних [60, 160]. В контрольних варіантах передпосівну обробку
насіння проводили дистильованою водою і пророщували, як вказано вище, з
врахуванням рекомендацій, методик наведених в роботах [70, 171]. Пророщування
проводили для контрольних і дослідних проб в ідентичних умовах протягом 4–5 діб
при температурі 260С в термостаті, щоденно визначали кількість пророслого
насіння, довжину надземної частини і коренів. Повторність дослідів шестикратна.
Проростки опромінювали за допомогою рентгенівського апарату ДРОН-4 дозами 0,129
і 1,29 Кл·кг-1 за таких умов: напруга 180 кВ, сила струму 40 мА, фільтри 0,5 мм
Сu, фокусна відстань 40 см, опромінення тотальне. Вплив іонізуючої радіації
досліджували через 4 години після одноразового опромінювання.
Виділення інтактних мітохондрій з проростків
гібридів кукурудзи
Операції по ізоляції мітохондрій проводили при температурі 0 – +40С. Посуд і
розчини були попередньо охолоджені до тієї ж температури. Надземну частину
4-добових етіольованих проростків кукурудзи, нарізували при розсіяному світлі,
промивали дистильованою водою, обсушували і охолоджували 20 хвилин при +40С.
При виділенні мітохондрій дотримувались рекомендацій Войникова В. К. та ін.
[27, 34].
Середовище виділення містило сахарозу (0,3 М), трис-НСl-буфер (0,05 М, рН 7,4),
ЕДТА (0,005 М), КСl (0,01 М), МgCl2 (0,001 М).
Наважку проростків швидко розтирали в агатовій або фарфоровій ступці,
послідовно заливали свіжими порціями середовища гомогенізації. На 20 г тканини
використовували 100 мл середовища гомогенізації. Гомогенат фільтрували через
капронову тканину. Фільтрат центрифугували 4 хв при 2000 g. Осад, який
складався з ядер, уламків клітинних структур відкидали. Мітохондріальну фракцію
отримували, центрифугуючи без’ядерний супернатант протягом 15 хвилин при 10000
g. Отриманий осад мітохондрій ресуспендували в середовищі, яке містило сахарозу
(0,3 М), трис-НСl-буфер (0,05 М, рН 7,4) і зберігали на холоді. 1 мл суспензії
мітохондрій містив ~6 мг мітохондріального білка.
Якість мітохондріальних препаратів, тобто їх функціональну повноцінність,
оцінювали за фосфорилуючою активністю, показниками якої є високий дихальний
контроль за Чансом і близькі до теоретичних величини відношень АДФ:О. Згідно
даним літератури [236, 239], значення КДК для інтактних мітохондрій рослин
зазвичай становить 2 – 5. Величини КДК і АДФ:О визначали полярографічним
методом. Ознакою інтактності мітохондрій вважали відсутність або низьку
величину ендогенного дихання (за відсутності в середовищі екзогенного субстрату
окиснення). Допустимий рівень ендогенного дихання становив 5–10 % від дихання
мітохондрій в четвертому субстратному стані за Чансом. До біохімічних
показників, які характеризують ступінь збереження мітохондрій слід віднести
також активне окиснення кислот циклу Кребса, стимуляцію дихання при додаванні
АДФ.
2.3. Дослідження інтенсивності тканинного дихання та окиснювального
фосфорилування полярографічним методом
Інтенсивність дихання та окиснювального фосфорилування визначали
полярографічним методом, який ґрунтується на реєстрації відновлення кисню на
катоді при подачі певного, залежного від характеристики електроду, потенціалу
[34, 105]. Струм, який при цьому виникає, пропорційний кількості молекул кисню,
які дифундують до вимірювального електроду. Якщо в замкнутому об’ємі
знаходиться поглинач кисню (мітохондрії), то за зміною величини струму можна
судити про швидкість дихання. Величину дифузійного струму ми визначали на
полярографі ПУ-1 у термостатованій кюветі за допомогою закритого платинового
електроду (електрод Кларка). Температура інкубаційного середовища становила +
250С. Полярографічну комірку об’ємом 1,5 мл заповнювали середовищем інкубації
мітохондрій, яке містило сахарозу (0,3 М), трис-HCl-буфер (0,05 М, рН 7,4), KCl
(0,01 М), KH2PO4 (0,018 М), БСА (бичачий сироватковий альбумін) (0,1 %), MgCl2
(0,005 М). Концентрація субстратів окиснення сукцинату і 2-оксоглутарату
становила 10 мМ. Для усунення оксалоацетатного інгібування дихання в комірку
вносили 0,003 М глутамату. Стимулювали дихання додаванням АДФ (200 мкМ) та
2,4-динітрофенолу (50 мкМ). Мітохондрії вноси
- Київ+380960830922