РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объект исследования
В настоящей работе использованы 270 половозрелых крыс-самцов линии Вистар массой 150-250 г, которых содержали в виварии Харьковского национального университета им. В.Н. Каразина. Объектом исследования была печень животных. Животные были разделены на группы в зависимости от задач эксперимента.
1. Контрольные животные, которым вводили соответствующий объем физиологического раствора.
2. Животные, которым подкожно вводили CdCl2?2,5 Н2О (0,28 % раствор в 0,9 % NaCl) в дозе 1,4 мг на 100 г массы тела [93]. Крыс брали в опыт через 15, 30 мин, 2, 6 и 24 ч после введения хлорида кадмия.
3. Животные, которым внутрибрюшинно вводили HgCl2 (0,1 % раствор в 0,9 % NaCl) в дозе 0,7 мг на 100 г массы тела [71]. Крыс брали в опыт через 1 и 18 ч после введения хлорида ртути.
4. Животные, которым внутримышечно вводили ?-токоферол (в форме ацетата, аптечный препарат) в дозе 5 мг на 100 г массы тела [172]. Крыс брали в опыт через 4 и 26 ч после введения ?-токоферола.
5. Животные, которым за 2 ч до введения хлорида кадмия или хлорида ртути внутримышечно вводили ?-токоферол (в указанных выше дозах). Крыс брали в опыт через 2 и 24 ч после введения хлорида кадмия или через 1 и 18 ч после введения хлорида ртути.
6. Животные, которым внутрибрюшинно вводили фенилгидразин (1,4 % раствор в 0,9 % NaCl) в дозе 7 мг на 100 г массы тела [161]. Крыс брали в опыт через 0,5, 2, 6 и 24 ч после введения фенилгидразина.
7. Животные, которым вводили глицерол (50 % водный раствор) в дозе 0,75 мл на 100 г массы тела внутримышечно по 0,5 дозы в каждую переднюю бедренную мышцу [162]. Крыс брали в опыт через 0,5, 2, 6, и 24 ч после введения глицерола.
8. Животные, которым внутрибрюшинно вводили циклогексимид (0,06% раствор в 0,9 % NaCl) в дозе 200 мкг на 100 г массы тела [173]. Крыс брали в опыт через 1 и 2,5 ч после введения циклогексимида.
9. Животные, которым за 0,5 ч до введения глицерола внутрибрюшинно вводили циклогексимид (в указанных выше дозах). Крыс брали в опыт через 0,5 и 2 ч после введения глицерола.
Обычно за 12 - 14 ч до опыта животных лишали корма без ограничения в питьевой воде. Животных декапитировали под легким эфирным наркозом.
Печень перфузировали холодным 0,9 % физиологическим раствором in situ через воротную вену, быстро извлекали и помещали в стаканчики с ледяным 0,9 % физиологическим раствором.
Все операции проводились на холоду.
2.2. Методы исследования
2.2.1. Определение 5-аминолевулинатсинтазной активности. 5-Аминолевулинатсинтазную активность определяли в 30%-ном гомогенате печени колориметрическим методом как описано в работе [110]. Навеску печени 1,5 г продавливали через пресс и гомогенизировали в 4,5 мл среды выделения в течение 15-20 с в гомогенизаторе с тефлоновым пестиком (скорость вращения - 600 об/мин, зазор стекло-тефлон 0,2 мм). Среда выделения: 0,9 % NaCl, 0,5 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-HCl, pH 7,4. Гомогенат фильтровали через 2 слоя неокрашенной капроновой ткани.
Данный колориметрический метод основан на том, что пиррол 5-аминолевулиновой кислоты образует окрашенное соединение при взаимодействии с реактивом Эрлиха.
Определение 5-АЛК-синтазной активности включает следующие этапы: 1) инкубация гомогената, в ходе которой образуется 5-АЛК;
2) синтез пиррола 5-АЛК при кипячении с ацетилацетоном;
3) отделение пиррола 5-АЛК от аминоацетона;
4) окрашивание пиррола 5-АЛК реактивом Эрлиха;
5) измерение интенсивности окраски полученного раствора.
Инкубация проводилась в стеклянных колбах объемом 10 мл на водяной бане при температуре 37?С при постоянном помешивании и свободном доступе воздуха. Состав реакционной смеси: 150 мМ трис-НСl, рН 7,4, содержащий 100 мМ глицин, 10 мМ ЭДТА и 0,2 мМ пиридоксаль-5-фосфат. Второй субстрат реакции - сукцинил-КоА - образуется в митохондриях при данных условиях инкубации в избытке [80]. Объем реакционной смеси составлял 1,5 мл, объем гомогената - 0,5 мл. В контрольные пробы перед добавлением гомогената добавляли по 0,5 мл 25% ТХУ. По окончании инкубации к опытным пробам добавляли по 0,5 мл 25% ТХУ и через 5-10 мин центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин.
Образовавшуюся 5-АЛК переводили в форму пиррола путем кипячения с ацетилацетоном. Для этого надосадочную жидкость переносили в пробирки высотой 20 см с притертой пробкой и добавляли 1мл ацетатного буфера, рН 4,6. После доведения рН раствора 2N NaOH (объем около 0,3 мл) до 4,6-5 добавляли 0,05 мл ацетилацетона. Кипячение проводили на водяной бане в течение 10 мин, погружая в воду только нижнюю часть пробирки до уровня реакционной смеси для уменьшения испарения исследуемой жидкости.
Поскольку наряду с 5-АЛК в клетке синтезируется аминоацетон (реакция синтеза аминоацетона из глицина и ацетил-КоА катализируется аминоацетонсинтазой), который завышает окраску раствора при окрашивании реактивом Эрлиха, проводили разделение пирролов 5-АЛК и аминоацетона, как описано в работе [174]. Для этого пробирки после кипячения охлаждали до комнатной температуры и доводили рН раствора до 7,0, добавляя смесь, содержащую 1 объем 0,5 M Na2HPO4 и 3 объема 1 N NaOH (примерный объем смесм, добавляемый в одну пробу, - 0,4-0,5 мл). Затем добавляли 8 мл хлористого метилена и смесь перемешивали строго 10 с. После раздела фаз из водной фазы отбирали 3 мл, к которым приливали равный объем реактива Эрлиха (2 N по перхлорной кислоте).
Измерение интенсивности окраски производили точно через 15 мин после добавления реактива Эрлиха при 540 нм на фотоколориметре ЛМФ-72 (СССР).
Активность фермента рассчитывали по количеству образовавшейся 5-АЛК и выражали в нмоль АЛК/мг белка за 1 ч инкубации [110].
2.2.2. Определение триптофан-2,3-диоксигеназной активности. Триптофан-2,3-диоксигеназную активность определяли спектрофотометрическим методом как описано в работе [10]. Метод определения триптофан-2,3-диоксигеназной активности основан на том, что при инкубации гомогената печени с