Фармакогностичне вивчення рослин роду Duschekia Opiz

РОЗДІЛ 2
ПОПЕРЕДНЄ ВИЗНАЧЕННЯ, ВИДІЛЕННЯ ТА ХІМІЧНЕ ВИВЧЕННЯ БІОЛОГІЧНО АКТИВНИХ РЕЧОВИН
ПРЕДСТАВНИКІВ РОДУ DUSCHEKIA OPIZ
2.1. Об’єкти та методи досліджень
За об’єкти дослідження були обрані кора, листки та супліддя трьох ви­дів
душекії (д. зелена, д. чагарникова і д. Максимовича), які були заготовлені у
2001-2004 рр. в ботанічних садах України та в Українських Карпатах. Зраз­ки
ідентифіковані та підтверджені з гербарним фондом ХНУ ім. В.Н. Кара­зіна та
гербарним фондом Інституту ботаніки ім. М.Г. Холод­ного АН Украї­ни. Кору
збирали на початку сокоруху, листя – після повного розгортання листкової
пластинки, супліддя – на початку дозрівання (зелені) та у фазі повної стиглості
(стиглі).
2.1.1. Якісне виявлення поліфенольних сполук
Для виявлення флавоноїдів, гідроксикумаринів та інших фенольних сполук у
витягах, елюатах і розчинах окремих фракцій використовували такі реакції:
* ціанідинову, при якій флавонолові аглікони і глікозиди дають червоне і
червоно-жовтогаряче забарвлення; пігменти агліконів розчинні в октанолі, а
глікозидів – у водному розчині спирту;
* з 10%-вим розчином гідроксиду натрію, при цьому спостерігається жов­то-буре
забарвлення (як для кумаринів, так і для флавоноїдів);
* з розчином заліза хлориду (III) – оксифлавоноїди дають жовто-буре чи
буро-зелене забарвлення;
* з реактивом Гіббса -6,8-незаміщені флавоноїди дають синьо-зелене забарвлення,
6-заміщені – синє, 8-заміщені – червоне забарвлення;
* при взаємодії з плюмбуму ацетатом флавоноїди, що містять о-діокси­групу в
в-кільці, утворюють жовтий осад;
* з реактивом Паулі на хроматограмах фенольні сполуки забарвлюються від жовтого
до жовто-бурого кольору [70].
2.1.2. Хроматографічний аналіз
Для хроматографічного аналізу використовували папір різних сортів, пластинки
для тонкошарової хроматографії виробництва Чехії, порошок це­люлози і
поліаміду.
На хроматограми наносили по 0,01-0,05 мл розчинів досліджуваних сполук або
витягів у залежності від чутливості якісних реакцій виявлення окремих
компонентів і концентрації речовин.
У випадку поділу складних сумішей фенольних сполук застосовували одно- і
двомірну хроматографію при одно- і багаторазовому проходженні розчинників, а
також спеціальні прийоми протилежно спрямованої хромато­графії, які сполучать
дві пари двовимірного поділу [71, 72].
Цей прийом виявився необхідним для відділення оксикоричних кислот від
флавоноїдів та їх окремого аналізу. Аглікони флавоноїдів малої поляр­ності
аналізували на імпрегнованому папері (25%-вий розчин формаміду в етанолі) у
системі бензол – етилацетат – кислота оцтова (30:70:1), 2-3 години при 15-25°С.
Більш полярні аглікони розділяли в системі бензол – етилацетат – кислота оцтова
(50:50:1), а також на сухому папері в системах 30%- і 60%- вої кислоти [72,
73].
Флавоноїдні глікозиди розділяли паперовою хроматографією у загаль­ноприйнятих
системах:
15%-, 30%-, 60%-ова кислота оцтова;
етилацетат – кислота мурашина – вода (10:2:3);
н-бутанол – кислота оцтова – вода (4:1:2) і (4:1:5) (система БОВ
викорис­товувалась також для тонкошарової хроматографії на пластин­ках
«Silufol»);
бензол – етилацетат – кислота оцтова (50:50:1) і (70:30:1) (низхідна
хро­матографія з імпрегнуванням формамідом) [74, 75].
Хроматографічний поділ похідних кумаринів проводили методами па­перової і
тонкошарової хроматографій з використанням розчин­ників:
хлороформ (низхідна хроматографія з імпрегнуванням формамідом);
петролейний ефір (низхідна хроматографія з імпрегнуванням формамі­дом), плями
ідентифікували за специфічною флюоресценцією в УФ-світлі та показниками Rf [76,
77, 78].
У ході хроматографічного аналізу на папері та тонкому шарі сорбенту проводили
якісні реакції:
з цирконільним реактивом; після обробки цим реактивом хромато­грами,
спостерігають зміну забарвлення плям в УФ- світлі до і після обробки парами
аміаку [79];
з 10%-вим розчином калію гідроксиду в 50%-вому метанолі, що міс­тить 2%
перекису водню; з цим реактивом у результаті різної окисності оксифлавоноїдів
з’являються жовті, жовто-бурі забарвлення, які швид­ко змінюються до
зеленуватих, блакитних, фіолетових чи жовтогаря­чих; ку­марини з розчином лугу
також дають жовте чи жовтогаряче за­барвлення;
з реактивом Бартона Бартона – на хроматограмі з’являються більш-менш яскраві
сині плями в наслідок окислювально-відновної реакції тривалентного заліза з
фенольними оксигрупами флавоноїдів і оксико­ричних кислот з утворенням
берлінської лазурі;
з реактивом Шмідта для виявлення оксикоричних кислот; хромато­граму обробляли
спиртовим розчином суміші п-сульфаніламіду і б-нафтолу, висушували і повторно
обробляли 1%-вим розчином натрію нітриту, з’являлося синьо-зелене забарвлення
плям на хроматограмах [74, 78].
Реактив Емерсона використовували для виявлення 6,8-незаміщених флавоноїдів по
синьо-зеленому і синьому забарвленню плям, а 6 і 8-замі­щених по бурому і
червоному забарвленню. Хроматограми послідовно обробляли 1%-вим розчином калію
фероціаніду і 2%-вим розчином аміноан­типірину в розчині калію фосфату
двозаміщеного [74, 73].
Для дослідження амінокислот, пептидів та інших речовин використову­вали
хроматографію на папері [71]. При цьому використовують низхідну, вис­хідну,
висхідно-низхідну, горизонтальну хроматографію, одномірний і двомірний поділ
амінокислот, багаторазове розділення хроматограми [72]. Для хроматографії на
папері застосовували хроматографічний папір, який не містить катіонів металів.
Амінокислоти розділяли в наступних системах: н-бутанол – кислота оцтова – вода
(БОВ) у співвідношеннях 4:1:1 та 4:1:2.
Перед проявленням хроматограму ретельно висушували для видалення розч