<p>РОЗДІЛ 2<br />ОБ‘ЄКТИ, МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИКА ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕНЬ<br />2.1. Місце, об'єкти, матеріал досліджень. <br /> <br />Робота виконувалась в лабораторії культури in vitro, теплицях Центру клонової<br />селекції, на дослідних ділянках ННЦ „Інститут виноградарства і виноробства ім.<br />В.Е.Таїрова’’ в 1994 - 2005 рр. у відповідності до програм НДР. <br />Дослідження проводили на клонах винограду столових, технічних і підщепних<br />сортів : 5861-Оригіналу, 2694- Муската гамбурзького, 371- Муската таїровського,<br />7251- Муската жемчужного, 7844-Одеського сувеніра, 441- Каберне Cовіньйон,<br />14172- Рислінга рейнського, 1294- Марсельського чорного раннього, 1791- Ріпаріа<br />х Рупестріс СО4, 4923- Ріпіаріа х Рупестріс 101 – 14, 21192 - Берландієрі х<br />Ріпаріа Кобера 5ББ. <br />В якості вихідного матеріалу для введення в культуру in vitro використовували<br />зелені пагони маточних кущів дослідних клонів, які вирощуються в теплицях, в<br />польових умовах - на клонодослідній ділянці відділу клонової селекції, а також<br />пагони, одержані шляхом пророщування визрілої лози в зимовий період. <br />В умовах закритого грунту кущі - донори культивуються в зимових теплицях<br />секційного типу Центру клонової і фітосанітарної селекції ІВіВ ім. В.Є.Таїрова.<br />Насадження закладені клоновим садивним матеріалом за схемою - 1,0 х 1,5 м;<br />система формування кущів - двоштамбовий кордон з висотою штамбу 70 см ; система<br />ведення кущів - на вертикальній 4-5-ярусній шпалері. Кущі вирощуються на<br />мінеральному субстраті, розробленому на основі цеоліту Сокирницького родовища<br />Закарпатської області. Це природний матеріал з іонно - обмінними властивостями,<br />який містить різноманітний набір мікроелементів і має сприятливі для розвитку<br />кореневої системи водно - фізичні властивості. Підготовка субстрату для<br />вирощування рослин здійснювалася за методикою, розробленою лабораторією<br />агрохімії інституту [93]. Вегетація виноградних кущів в теплиці починається на<br />1 - 1,5 місяці раніше і закінчується на 1 місяць пізніше ніж в польових умовах.<br />Визрівання лози у всіх сортів добре. <br />На клонодослідній ділянці кущі посаджені в 1984-1989 рр. Схема садіння 2,5 х<br />1,5 м, формування – двосторонній горизонтальний кордон з висотою штамбу 70 см. <br />Кущі винограду проходили візуальне фітосанітарне обстеження і систематичне<br />тестування на відсутність прихованої вірусної і бактеріальної інфекції<br />спеціалістами лабораторії вірусології. <br />Визрілу лозу дослідних клонів для проведення досліджень в зимовий період<br />заготовляли з кущів, які ростуть на клонодослідній ділянці в листопаді. Лози<br />відбирали приблизно однакового діаметру – 8-9 мм і довжини – 50 см. <br />Вихідним матеріалом для введення в стерильну культуру були зелені пагони в фазі<br />активного росту довжиною 7,0 - 8,0 см. Пагони відбирали вранці з 8 до 9 години.<br />Матеріалом досліджень особливостей розвитку винограду в культурі in vitro були<br />ініціальні експланти – одновічкові мікрочубуки вихідних пагонів, мікроклони,<br />мікрочубуки мікроклонів з прилеглим листком, в умовах in vivo – адаптовані<br />мікроклони. <br />2.2 Методика досліджень<br />При проведенні досліджень були використані методичні рекомендації Р. Г. Бутенко<br />[17], П. Я. Голодриги, В.А. Зленко та ін. [35], G. Brendel [116] . <br />Зелені пагони для введення в культуру in vitro відбирали з кущів винограду<br />дослідних клонів на протязі всього вегетаційного періоду. <br />Визначення оптимального типу вихідного матеріалу в залежності від походження<br />проводили шляхом дослідження регенераційної здатності експлантів пагонів: <br /> - кущів, що вирощуються на клонодослідній ділянці;<br /> - кущів, які культивуються в теплицях Центру клонової селекції;<br />- одержаних в результаті пророщування визрілої лози в зимовий період. <br />Зелені пагони довжиною 8-9см з 7 - 8 вузлами зрізали, і в зволоженому<br />фільтрувальному папері доставляли в лабораторію. Від пагонів скальпелем<br />відтинали листя з черешками, лусочки. Очищені пагони поміщали в хімічні стакани<br />об’ємом 200-500 мл3 і промивали під проточною водою впродовж 30 - 40 хвилин. <br />Для визначення оптимального режиму стерилізації вихідного матеріалу були<br />випробувані розчини стерилізуючих агентів різної концентрації та умови різної<br />експозиції (концентрації і тривалість експозиції були визначені нашими<br />попередніми рекогносцирувальними дослідами): сульфохлорантину (0,2% ; 0,5%),<br />гіпохлориту кальцію ( 2% ; 5%) – 5; 8 хв., 700 і 600 етанол - 20; 30 сек.<br />Обробку мікрочубуків розчинами стерилізуючих агентів, проводили в стерильних<br />скляних стаканах. Введення експлантів в культуру, а також всі роботи, пов'язані<br />з розмноженням in vitro, здійснювали в асептичних умовах в ламінарних боксах,<br />обладнаних пилозахисними камерами зі стерильною подачею повітря типу СМ - 5 і<br />ультрафіолетовими опромінювачами типу УТД - 2. <br />Для визначення оптимального типу ініціальних експлантів для клонального<br />мікророзмноження винограду досліджували особливості розвитку мікрочубуків, що<br />розрізняються: <br />- місцезнаходженням на вихідному пагоні : на рівні 1, 2, 3, 4, 5, 6-го вузлів<br />від верхівки пагона; <br /> - розміром експлантів : 0,3 – 0,7 см; 0,8 – 1,0 см ; 1,2 - 1,5 см. <br />Вихідні пагони розділяли на одновічкові мікрочубуки в асептичних умовах.<br />Ініціальні експланти висаджували на агаризоване поживне середовище в скляні<br />культиваційні стакани (діаметр – 40 мм, висота – 150мм ). Об'єм поживного<br />середовища складав 20 мл3 , іонітного поживного субстрату – 45 - 50см3. Стакани<br />закривали кришками з фольги. Експланти культивували в вегетаційних боксах при<br />сталих фізичних параметрах : t0 = + 27 0 С, освітленості 3 000 лк, 16 -<br />годинному фотоперіоді; вологості повітря - 70 %. <br />Спостереження за розвитком ініціавльних експлантів проводили за показниками : <br /> - рівень інфікованості (%);<br /> - приживлюваність (%) ;</p>
- Київ+380960830922