ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы и объекты исследования
В экспериментах использовались белые крысы раннего возраста (7-10 дней) с
массой тела 10-15 г и взрослые (3-4 мес) с массой тела 150-200 г, полученные из
вивария Института фармакологии и токсикологии АМН Украины. Животных содержали в
стандартных условиях. На каждую фармакокинетическую точку брали не менее 6
крыс. В соответствии с приведенными в методических рекомендациях по
фармакологическому изучению возрастных особенностей в действии лекарственных
средств, предлагаемых для клинического изучения в педиатрической практике [67],
эквивалентами возраста белой крысы и человека, вычисленными по величинам
истинной скорости роста, экспериментальные данные, полученные при
экспериментальных исследованиях лабораторных животных 7-10 дней, экстраполируют
на человека в возрасте от 4 месяцев до 1,5 лет, животных 3-4 месяцев - на
человека в возрасте 14-17 лет.
Препарат Ламиктал фирмы «Glaxo Wellcome Operations», Великобритания
(международное непатентованное название - ламотриджин) вводили перорально в
дозе 10 мг/кг в виде водно-спиртового раствора. Использованная в исследованиях
доза ламотриджина определялась на основании приведенных в научной литературе
данных относительно его экспериментального изучения [109, 143, 179]. Для
определения биодоступности как альтернатива внутривенного (в связи с
практической невозможностью его применения у крыс раннего возраста) был
использован внутрибрюшинный способ введения препарата [67]. Пробы крови и
головного мозга (после декапитации крыс) после перорального введения отбирали
через 0,5; 1; 2; 4; 8; 12; 24 и 48 часов.
Препарат Топамакс фирмы «Janssen-Cilag», Голландия (международное
непатентованное название - топирамат) вводили внутрибрюшинно и перорально в
дозе 25 мг/кг в виде водно-спиртового раствора. Выбор дозы был обусловлен
данными литературы относительно клинических исследований топирамата [115, 148].
Пробы крови и головного мозга (после декапитации крыс) отбирали через 0,25;
0,75; 0,5; 1; 4; 8; 12 и 24 часа.
2.2. Методы исследования
2.2.2. Определение ламотриджина в крови и головном мозге
Концентрацию активной субстанции препарата определяли методом ВЭЖХ. Образцы
крови непосредственно после взятия центрифугировали для отделения сыворотки.
Ткань головного мозга гомогенизировали (гомогенизатор стекло/стекло).
Извлечение активной субстанции из сыворотки (головного мозга) осуществляли по
методике [105] в нашей модификации: к 0,5 мл сыворотки (0,5-1г головного мозга)
добавляли 2 капли насыщенного раствора хлорида натрия и 2 мл этанола. Смесь
перемешивали, кипятили в течение 1 минуты, охлаждали до комнатной температуры,
затем центрифугировали (20 мин., 8 тыс. об/мин), прозрачный раствор
декантировали. К остатку добавляли 2 мл этанола и повторяли вышеописанную
процедуру. Полученные растворы объединяли, упаривали до 0,3-0,5 мл, затем
охлаждали и центрифугировали.
Полученный раствор хроматографировали на жидкостном хроматографе PERKIN ELMER
Series 200 (США). Использовалась обращенно-фазовая хроматографическая колонка X
terra RP-18 (250 х 3 мм) с диаметром частиц 5 мкм. Подвижная фаза представляла
собой смесь фосфатного буфера (5,5г К2НРО4*3Н2О в 1л воды, рН доводилось до 2,5
добавлением фосфорной кислоты) и ацетонитрила в соотношении 80:20 (об. %).
Скорость потока элюента 0,4 мл/мин; УФ детектор: l = 210 нм. Время выхода – 8,6
мин. Концентрацию ламотриджина определяли методом абсолютной калибровки. Предел
детектирования препарата составлял 200 нг/мл (г) (сыворотки/головного мозга).
Рис. 2.1. Хроматограмма ламотриджина при построении калибровочной кривой.
Рис. 2.2. Хроматограмма ламотриджина в мозге взрослых крыс.
Рис. 2.3. Хроматограмма ламотриджина в мозге крыс раннего возраста.
2.2.3. Определение топирамата в крови и головном мозге
Концентрацию активной субстанции препарата определяли методом ВЭЖХ. Образцы
крови непосредственно после взятия центрифугировали для отделения сыворотки.
Ткань головного мозга гомогенизировали (гомогенизатор стекло/стекло). Обработку
проб крови и головного мозга осуществляли методом [104] в нашей модификации. К
0,5 мл сыворотки (0,5-1 г головного мозга) добавляли 2,5 мл диэтилового эфира,
встряхивали на миксере в течение 30 сек., затем центрифугировали для отделения
от нерастворимых примесей (10 мин.,15 тыс.об/мин), супернатант упаривали досуха
на водяной бане, остаток разводили 0,5 мл горячего ацетонитрила, охлаждали,
фильтровали и полученный раствор хроматографировали.
Хроматографические анализы проводили на жидкостном хроматографе Hewlett
Packard, обращенно-фазовая колонка Nucleosil-5 С-18 (250 х 4мм), размер частиц
6мкм. Подвижная фаза представляла собой смесь ацетатного буфера (рН 6,3) и
ацетонитрила в соотношении 60 : 40 (об.%). Скорость потока элюента 0,8 мл/мин,
УФ детектор: l = 254 нм, время выхода – 4,3 мин. Концентрацию топирамата
определяли методом абсолютной калибровки. Предел детектирования препарата
составлял 100 нг/мл (г) (сыворотки/головного мозга).
Рис. 2.4. Хроматограмма топирамата при построении калибровочной кривой.
Рис. 2.5. Хроматограмма топирамата в мозге взрослых крыс.
Рис. 2.6. Хроматограмма топирамата в мозге крыс раннего возраста.
2.3. Кинетический анализ
Основной целью фармакокинетических исследований является количественный анализ
и описание процессов поглощения, распределения метаболизма и выведения
лекарственных средств из организма [36, 62]. Для того чтобы количественно
описать характер этих процессов, создаются специальные кинетические модели.
Модель представляет собой упрощенное представление
- Київ+380960830922