РОЗДІЛ 2
ВИБІР НАПРЯМКІВ ДОСЛІДЖЕНЬ, МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИ ВИКОНАННЯ РОБОТИ
Дисертаційна робота виконана упродовж 1999-2006 рр. на кафедрах фізіології, патофізіології та імунології тварин, паразитології та тропічної ветеринарії факультету ветеринарної медицини Національного аграрного університету. Окремі дослідження виконані у біохімічному відділі загальної токсикології і медико-біологічних досліджень Науково-дослідного інституту екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя. Гістоморфологічні дослідження проводили у лабораторії Українського НДІ травматології і ортопедії МОЗ України та на кафедрі патологічної анатомії Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця.
Дослідження проводили у чотири етапи (рис. 2.1.)
На першому етапі була сформована дослідна група із 10 корів чорно-рябої породи віком 2,5-5 років, спонтанно інвазованих збудником сетаріозу. У цих тварин з характерною клінікою захворювання відбирали кров з вуха та яремної вени вранці до годівлі для морфологічних, біохімічних і гельмінтоларвоскопічних досліджень. В якості антикоагулянта використовували розчин гепарину або лимоннокислого натрію.
Гельмінтоларвоскопію проводили методом розчавленої краплі за М.І. Романовичем [153] (виявлення мікросетарій в краплі крові з периферійних судин) та центрифугуванням венозної крові за Т.І. Поповою [130].
Для гістологічних досліджень відбирали також проби тканин печінки, нирок, легень і серця у забитих тварин розміром 1 х 1 х 0,3 см, які фіксували у 10% нейтральному формаліні. Зрізи тканин фарбували гематоксиліном та еозином [52] і вивчали під мікроскопом МБІ-15 (об. 40 х ок. 10).
Одночасно від забитих тварин відбирали статевозрілих сетарій, які ідентифікували як Setaria labiato-papillosa за В.М. Івашкіним і С.А. Мухамадієвим [56]. Зібраних гельмінтів кілька разів промивали фізіологічним розчином, висушували між листами фільтрувального паперу та швидко заморожували. Отримання білкових екстрактів (суспензії) та подальші дослідження проводили за схемою N.H. Kenta (1963). Свіжозаморожених гельмінтів дробили у електричному гомогенізаторі з абсолютним етанолом, охолодженим до -20 ?С, при 7-8 тис. об./хв упродовж 30 хв. Потім, в отриманий гомогенат, додавали невелику кількість охолодженого абсолютного етанолу і залишали при - 70 ?С на одну годину, знежирювання проводили рівним об'ємом ефіру при такій же температурі протягом 2-3 годин. З отриманого знежиреного порошку екстрагували білки протягом 48 годин у 0,05 трис-HCI буферному розчині, рН 7,2-7,6. Екстракт отримували центрифугуванням при 6-7 тис. об./хв упродовж 15-20 хв. Стандартизацію суспензії проводили за вмістом білка, який визначали згідно О.В. Lowry і ін. (1995).
На другому етапі для проведення досліджень були сформовані дослідні групи із лабораторних тварин: морські свинки масою 250-300 г, кролі - 2-2,5 кг, щурі - 200-250 г, по 36 тварин у кожній. Тварин утримували при температурі 18 ?С в умовах віварію кафедри фізіології, патофізіології та імунології тварин. Вони мали вільний доступ до води та корму. Раціон у них був повноцінним і одноманітним упродовж всього періоду досліджень. Лабораторні тварини перебували під постійним клінічним наглядом і були вільні від інфекційних, інвазійних та незаразних хвороб.
Тваринам дослідних груп внутрішньом?язово вводили суспензію із сетарій з розрахунку 100 мг білка на 1 кг маси тіла. Тваринам контрольних груп вводили фізіологічний розчин у такій же дозі. Тваринам окремо сформованої групи з 5 морських свинок через 14 діб вводили повторно цю суспензію. При цьому контролем слугували тварини із групи клінічно здорових.
Кров для морфологічних і біохімічних досліджень відбирали через 1, 12 та 24 години після введення суспензії. Кров у морських свинок відбирали з лапки, у кролів - після надрізу крайової вени вуха, у щурів ? з хвоста після надрізу латеральної його поверхні.
У вимушено забитих морських свинок через 24 години, після введення їм суспензії із сетарій, відбирали проби окремих органів для біохімічних та гістологічних досліджень. Проби для біохімічних досліджень гомогенізували в скляному гомогенізаторі з тефлоновим поршнем з добавкою охолодженого до температури +4 ?С Кребс-Рінгер фосфатного буферу (рН 7,4), із розрахунку 1:9. В гомогенатах визначали вміст загального білка, альбуміну, сечовини, концентрацію глюкози, активність АсАТ, АлАТ, КК, ЛДГ, ЛФ. Дослідження змін гістоструктури окремих тканин у 12 морських свинок проводили через 24 години, після уведення їм суспензії із самок сетарій.
На третьому етапі досліджень вивчали вплив на організм морських свинок денатурованої суспензії із сетарій. Для цього суспензію охолоджували і центрифугували при 5-6 тис. об./хв упродовж 5-7 хв (для осадження білків). Отриману суспензію вводили внутрішньом'язово в ділянці стегна 36 морським свинкам дослідної групи у дозі 0,1 см3. Проби крові відбирали для морфологічних та біохімічних досліджень через 1, 12 та 24 години. Таку ж суспензію вводили 5 морським свинкам повторно через 14 діб та спостерігали за розвитком клінічних проявів.
На четвертому етапі досліджень 12 морським свинкам вводили альбумін у подушечку правої лапки у дозі 0,1 см3. Через 14 діб тваринам дослідної групи альбумін вводили повторно. Тваринам контрольної групи повторно вводили фізіологічний розчин у такій же дозі.
Клінічні дослідження тварин (визначення температури тіла, частоти пульсу, дихання) проводили за загальноприйнятими методами [138]. Підготовку проб і визначення конкретних показників проводили згідно з інструкцією до приладу і реактивів.
Для дослідження лейкограми мазки крові фарбували за Романовським-Гімза [85]. Швидкість осідання еритроцитів (ШОЕ) визначали за методом Т.П. Панченкова [79].
Біохімічні показники крові досліджували за допомогою біохімічного аналізатора "Microlab-200" (Нідерланди) закритого типу з проточною кюветою, а також загальноприйнятими методами:
* вміст загального білка - рефракт