РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріал дослідження
Матеріалом для дослідження секреторних компонентів людей в нормі послужили серця 79 людей різної статі юнацького, зрілого, похилого та старечого віку, які померли від захворювань патогенетично не пов'язаних з патологією серцево-судинної системи (табл. 2.1).
Таблиця 2.1
Розподіл сердець людей на групи за віком.
№ з/пВікСтатьВікові межіКількість сердець1.Юнацькийчоловіча17-21 роки11жіноча16-20 років52.Зрілийчоловіча22-60 років21жіноча21-55 років103.Похилийчоловіча61-74 роки11жіноча56-74 роки54.Старечийчоловіча75-90 років8жіноча75-90 років8
Забір людського матеріалу для дослідження проводили на базі судово-медичного моргу Дніпропетровського обласного бюро судово-медичної експертизи, де безпосередньо проводилось морфометричне дослідження сердець, а для подальшого дослідження забирали шматочки з різних відділів серця (лівих і правих передніх відділів шлуночків, передсердь та серцевих вушок), які включали усі шари міокарда. Всі дослідження проводили з дотриманням принципів біомедичної етики , що засвідчено комісією з біомедичної етики Дніпропетровської державної медичної академії (протокол засідання № 2 від 14 лютого 2005 р.)
Матеріалом для дослідження секреторних компонентів серця в експерименті послужили 47 білих статевозрілих щурів самців лінії Вістар вагою 160-180 грамів віком 4-6 місяців.
Щурів було розподілено на дві основні групи (табл. 2.2).
Таблиця 2.2
Розподіл дослідних тварин на групи.
№ групиВид експериментуТривалість експериментуКількість дослідних тварин1Дослідження впливу гемодинамічного перевантаження серця1 доба53 доби55 діб510 діб530 діб5Контроль-52Дослідження впливу хімічних речовинДослідження впливу адреналінуОднократне введення5Дослідження впливу дексаметазонуОднократне введення45 діб4Контроль-4
Першу групу складали щури, яким шляхом оперативного втручання створювали перешкоду відтоку крові з лівого шлуночка для вивчення впливу гемодинамічного перевантаження міокарда на стан секреторних компонентів серця (Пат. № 6234 від 15.04.05). Ця група була представлена 30-ма тваринами, які складали 5 експериментальних підгруп в залежності від терміну дії чинника (1, 3, 5, 10, 30 діб) по 5 щурів в кожній, ще 5 щурів складали контрольну групу.
В другій групі вивчали вплив хімчних речовин на стан секреторних компонентів серця. Вона складалась із трьох дослідних підгруп: в першій досліджували вплив адреналіну після його однократного введення (5 щурів), в другій - вплив дексаметазону після однократного введення (4 щури) і в третій - вплив дексаметазону після систематичного введення на протязі 5 діб (4 щури), 4 щури складали групу контролю (табл. 2.2).
Дослідних тварин утримували в звичайних умовах віварію в стандартній клітці, за якими проводили систематичний нагляд, добовий раціон щурів не відрізнявся від стандартного. Експериментальні дослідження та утримання щурів проводили у відповідності до "Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються для дослідницьких, та інших наукових цілей", Страсбург, 18.03.86., що засвідчено комісією з біомедичної етики Дніпропетровської державної медичної академії (протокол засідання № 2 від 14 лютого 2005 р.) По закінченні терміну дослідження тварин виводили з експерименту згідно з "Методичними рекомендаціями по виведенню тварин з експерименту" (1985).
2.2. Методи дослідження
Виконуючи поставлені задачі в даній дисертаційній роботі було використано комплекс методик, який включав в себе експериментальні, морфологічні, морфометричні методи. Отримані результати оброблялися за допомогою варіаційно-статистичних методик.
2.2.1. Морфологічні методи.
2.2.1.1. Препарування.
Препарування сердець людей та експериментальних тварин проводили з метою виділення їх з грудної порожнини та вивчення макроскопічних показників: довжини, висоти, ширини, а також товщини стінки окремих відділів серця.
2.2.1.2. Гістологічне дослідження міокарда.
З метою візуалізації та вивчення гістологічної структури секреторних компонентів окремих відділів міокарда сердець людей різного віку та експериментальних щурів було проведено виготовлення гістологічних препаратів, у тому числі і напівтонких зрізів.
Шматочки досліджуваної тканинии розмірами до 1см3 фіксували у 10% розчині нейтрального формаліну. Після цього проводили зневоднення матеріалу за загальноприйнятою методикою у спиртах зі зростаючою концентрацією, далі вилучали спирт із застосуванням о-ксилолу і укладали в парафінові блоки. З блоків виготовляли зрізи товщиною 5-7 мкм на санному мікротомі МС-2.
Для вивчення складових компонентів серцевої стінки: кардіоміоцитів, волоконних та клітинних компонентів сполучної тканини, а особливо тканинних базофілів серця зрізи фарбували гематоксилін-еозином (кислим гемалауном Майєра з наступним дофарбуванням 0,1% водним розчином еозину) та 2 % розчином толуїдинового синього. Пофарбовані зрізи заключали в бальзам під покривним склом. Приготування блоків із шматочків тканини при виготовленні напівтонких зрізів виконувалося за загальноприйнятою методикою. Отримані зрізи товщиною 1-2 мкм фарбували 2% розчином толуїдінового синього і вивчали під бінокулярним мікроскопом Leica на імерсійному збільшенні у 1000 разів з наступним фотографуванням.
2.2.1.3. Імуногістохімічний метод.
Даний метод використовували для ідентифікації секреторних гранул кардіоміоцитів сердець людей різного віку і проводили на базі Діагностичного центру медичної академії, м. Дніпропетровськ. Принцип методики полягає в з'єднанні строго специфічного моноклонального антитіла з відповідним антигеном з наступною світлооптичною візуалізацією. Для цього шматочки досліджуваної тканинии розмірами до 1см3 фіксували у 10% розчині нейтрального формаліну. Далі з них виготовляли парафінові блоки, з яких за допомогою мікр