РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ Й МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Вивчення енергообміну та біосинтезу сегменту тонкої кишки, в межах якого виконана ентеротомія й трансплантація ембріональних тканин, проведено на 110 кролях, яких розділено на 4 групи.
Першій групі тварин (28 кролів) виконано алотрансплантацію ембріона- льної очеревини, другій (28 кролів) - алотрансплантацію ембріональної шкіри. Кожній тварині пересаджено 3 клапті ембріональної тканини на послідовно сформовані зашиті рани тонкої кишки за загальноприйнятою методикою.
Окремі дві групи (контрольні) склали тварини, в яких досліджували процеси енергообміну та біосинтезу в звичайних умовах (12 кролів) та після контрольної ентеротомії, виконаної за прийнятою методикою з однорядним швом рани кишки (12 кролів).
30 кролям пересаджено ембріональні остеобласти в кісткову рану.
Кров для досліджень (10 мл) забирали із нижньої порожнистої вени після її катетеризації катетером діаметром 0,6 мм.
Кролів виводили з експерименту на 3, 7, 14, 30, 60, 90, 180-й день після операції за загальнопринятою методикою [37]. Виконували серединну лапаротомію, проводили резекцію досліджуваного сегменту тонкої кишки, відділяючи кишкову трубку від брижі. Кишку розтинали вздовж брижеєчного краю й відмивали декілька разів охолодженим до температури +40° С ізотонічним розчином хлориду натрію, висушували фільтрувальним папером і переносили на льодяну баню.
Окрім того, проведено дослідження показників енергообміну та біосинтезу ембріональних тканин (очеревини, шкіри) й клітин (остеобласти), які одержували в час забору матеріалу для трансплантації.
Рис. 2. 1. Досліджувані показники енергообміну та біосинтезу
2. 1. Методика ентеротомії
Оперативні втручання виконували в умовах операційної зі строгим дотриманням загальноприйнятих принципів асептики й антисептики.
Тварини оперовані через 30 хв після стандартної премедикації (атропін 0,1 % р-н 25 - 30 мг/кг, димедрол 1,0 % р-н 10 - 20 мг/кг, промедол 1,0 % р-н 6 - 10 мг/кг) під комбінованим дом'язовим наркозом (кеталар 8 - 10 мг/кг, гексенал 1% р-н 20 - 30 мг/кг, оксибутират натрію 20 % р-н 80 - 100 мг/кг).
Операцію виконували із середньо-серединного лапаротомного доступу. Після ревізії органів черевної порожнини, при відсутності патології у рану виводили петлю тонкої кишки. Відтак проводили поздовжну ентеротомію довжиною 1,5 - 2,0 см. Рану кишки або залишали відкритою, або зашивали вузловими серозно-м'язовими однорядними поздовжніми швами з використан- ням мікрохірургічного інструментарію та атравматичного шовного матеріалу (prolen 6,0). Лапаротомну рану зашивали поодинокими вузловими швами через усі шари. Черевну порожнину не дренували. У післяопераційному періоді медикаментозної терапії не проводили, тварини перебували в звичайних умовах. Впродовж першої доби тварини не одержували їжі.
2. 2. Методика трансплантації ембріональних тканин
Донором служила самка в кінці другого чи на початку третього тижня вагітності. Термін вагітності вираховували від дня спарування, після якого самку ізолювали, й підтверджували мануальним дослідженням за розмірами матки.
Матеріал для трансплантації забирали безпосередньо перед операцією. В операційній зі строгим дотриманням асептичних умов під наркозом виконували екстирпацію матки й видаляли ембріони. Ембріони відмивали ізотонічним розчином хлориду натрію. Після обробки шкіри йодонатом підковоподібним розрізом з двох сторін від здухвинних ділянок вертикально вверх і потім паралельно реберним дугам викроювали клапоть передньої черевної стінки. За допомогою мікрохірургічної техніки сепарували шкіру та м'язово-апоневротично-очеревинний пласт, який в подальшому умовно називали очеревиною. Виділити окрему очеревину було неможливо оскільки епітеліальні пластинки товщиною менше 0,1 мм не вдається забирати ніякими інструментами [97]. З тканин викроювали клапті діаметром 1,5 - 2,0 см й переносили в розчин Колінза, в якому й зберігали при температурі +40° С до моменту трансплантації. Після виконання операції ентеротомії поверх зашитої чи незашитої рани накладали латку ембріональної тканини, яку фіксували з допомогою 4-х діаметрально протилежних серозно-м'язових швів.
2.3. Методика виділення та трансплантаціі ембріональних остеобластів
Дефект кісток передпліччя створювали, випилюючи за допомогою фрези сегмент діафізу довжиною 2 см. Застосування фрези давало змогу сформувати рівну ранову поверхню, уникнути розпилення кістки в рані, зберегти сусідню кістку, яка надалі ставала опорною й, таким чином, створити одинакові умови остеогенезу для обох кінцівок. Дефект кістки однієї з кінцівок заміщали трансплантатом, друга кінцівка служила контролем.
Для виділення остеобластів використовували росткові зони трубчатих кісток кінцівок трьохтижневого ембріона кроля. Під мікроскопом МБІ-6 при чотирьохразовому збільшенні в умовах темного поля локалізували росткові зони кісток і висікали їх. Одержаний матеріал гомогенізували.
Для одномоментної трансплантації використовували 200-300 мг клітинної суспензії. Перед операцією клітинну масу фіксували за допомогою фібринового клею, моделюючи одночасно й дефект кістки. Розчини компонентів фібринового клею готували безпосередньо перед застосуванням, для чого 100 мг фібриногену розчиняли в 1 мл гордоксу (20 тис. ОД) і 100 ОД тромбіну в 1 мл розчину Рінгера, збагаченому іонами кальцію в концентрації 0,1 - 0,11 мг%. Відтак компоненти підігрівали до температури 36 - 37° С, зберігаючи їх до моменту використання.
Трансплантат фіксували за допомогою фібринового клею, що давало змогу адекватно відтворити кістковий дефект, чим попереджувалося надмірне розростання кісткової тканини в майбутньому, зупинити кровотечу з ранової поверхні, надійно фіксувати трансплантат у рані. Операцію виконували у статевозрілих самців під внутрім'язовим гексенал-кеталаровим наркозом.
Кролів виводили з експерименту на 3, 7, 14 день після операції шляхом пропускання електроструму через довгастий та спинний мозок. Подальші до
- Київ+380960830922