РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дослідження проводили з 2000 по 2004 рік в умовах лабораторії кафедри вірусології, патанатомії та ветеринарно-санітарної експертизи Сумського НАУ, Полтавської обласної державної лабораторії ветеринарної медицини, Центральної державної лабораторії ветеринарної медицини, біохімічної лабораторії 4-ї міської поліклініки м. Полтава, птахівничих господарств різних технологічних напрямків та форм власності Сумської та Полтавської областей (ВАТ "Мирний" Сумського району, Агрофірма "Авангард" м.Білопілля, птахорадгосп ВАТ "Посульський" Недригай-лівського району, ТзОВ "Горлиця" Краснопільського району, ВАТ ім. Путивльських партизан Путивльського району Сумської області та ЗАТ "Лубниптиця" Лубенського району, агрофірма ім. Шевченка Полтавського району, ЗАТ "Полтавська птахофабрика" Диканського району, Інкубаторне птахопідприємство Миргородського району, ПП "Зоря" Полтавського району, АТ "Злагода" Полтавського району, Агрофірма "Джерело" Полтав-ського району, Полтавське інкубаційне птахопідприємство, СТОВ "Тростянець" Полтавського району, агрофірма "Нова Галещина" Козель-щинського району, ВАТ "Бурякорадгосп Ланновський" Карлівського району Полтавської області).
У лабораторних дослідах використано 485 курчат породи Ломан-вайт 10-добового віку, на яких експериментально відтворювали захворювання; 252 морських свинки масою 400-450 г - для постановки біопроби та 336 білих мишей масою 16-18 г - для типізації культур у реакції нейтралізації.
Епізоотологічні, клінічні та патологоанатомічні дослідження прово-дили за загальноприйнятими методиками.
Вивчення особливостей перебігу епізоотичного процесу в сільсько-господарської птиці проводили на поголів'ї курей, гусей та качок із використанням методики епізоотологічного моніторингу; визначали показ-ники захворюваності, смертності, летальності за методикою І.А. Бакулова (2000) [15]. Для досліджень використовували молодняк та дорослу птицю.
2.1. Методи ізоляції та ідентифікації C. perfringens
Ізоляцію мікроорганізмів із патологічного матеріалу, вивчення їх морфологічних, культуральних, біохімічних та вірулентних властивостей проводили за методиками, які представлені в довіднику "Лабораторные исследования в ветеринарии. Бактериальные инфекции" [5] та відповідно до методичних вказівок "Лабораторна діагностика інфекційної ентеро-токсемії тварин" (затверджені Науково-методичною радою Державного департаменту ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України 20 грудня 2001 року) [28].
Видову ідентифікацію ізольованих штамів здійснювали за "Кратким определителем бактерий Берги" [68].
Бактеріологічне дослідження патологічного матеріалу на предмет виявлення мікроорганізмів роду клостридіум проводили за схемою (рис. 2.2).
Рис. 2.1. Схема лабораторного дослідження на клостридіози птиці
Мазки-відбитки готували з паренхіматозних органів та вмісту тонко-го відділу кишечника, фіксували над полум'ям і фарбували за Грамом.
Посіви робили з серця, печінки, кісткового мозку, кишечника на середовища Кітт-Тароцці та Вільсон-Блера. Перед посівом середовище Кітт-Тароцці регенерували - прогрівали на водяній бані до температури 100±1єС протягом 15-30 хв., після чого швидко охолоджували до 45-50°С. Посіви інкубували за температури 37±1єС протягом 18-24 год. Враховуючи важливу особливість Clostridium perfringens - здатність швидко рости; для виділення чистих культур на середовищі Кітт-Тароцці використовували метод багаторазових пересівів. Для цього із засіяних пробірок через кожні 2-3 години при виникненні каламуті й газоутворення робили пересіви в регенероване середовище Кітт-Тароцці. Після 3-5 таких пересівів культури висівали в чашки Петрі з кров'яним глюкозним м'ясо-пептонним аґаром (КГМПА). Чашки з посівами інкубували в анаеростаті при 37-38°С протягом 48-72 годин.
Характерні колонії з КГМПА відсівали на середовища Кітт-Тароцці та МПА (контроль на чистоту росту). Інкубували протягом 16-24 годин при 37°С. Виділені колонії досліджували під мікроскопом XSP-139TP із системою аналізу зображення. Мазки з колоній фіксували над полум'ям та фарбували за Грамом.
У дослідах використовували середовище Вільсон-Блера, виготов-лене Державним експериментальним заводом медпрепаратів ІБОНХ НАНУ. Середовища КГМПА, МПА, Кітт-Тароцці готували згідно з ГОСТом 10444.1-84 "КОНСЕРВИ. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологи-ческом анализе" [38].
Отриману таким чином культуру перевіряли на цукролітичні та протеолітичні властивості, патогенність і визначали тип дії її токсину в реакції нейтралізації з типоспецифічними сироватками.
Чутливість виділених культур C. perfringens до антибіотиків визначали методом дискоіндикації відповідно до "Методичних вказівок з визначення чутливості до антибіотиків збудників інфекційних хвороб сільськогосподарських тварин" [79] і у власній модифікації на чашках Петрі з середовищем Вільсон-Блера. На середовище висівали 0,25 cм3 18-24-годинної бульйонної культури, коливанням чашки рівномірно розпо-діляли по всій поверхні середовища на 0,5 години, після чого надлишок рідини видаляли. На поверхню засіяного середовища розкладали диски з антибіотиками і заливали розплавленим середовищем Вільсон-Блера. Інкубацію проводили в термостаті при 37°С протягом 24 годин. Результати оцінювали за визначенням діаметру зон затримки росту навколо дисків.
Цукролітичні властивості вивчали на середовищі Гісса, виготовлені НПО "Питательные среды", м. Махачкала, з відповідними цукрами для визначення біохімічних властивостей мікроорганізмів. Для цього до сере-довища Гісса додавали цистеїну хлоргідрату з розрахунку 0,02 %. Перед посівом пробірки із середовищем прогрівали на водяній бані до розплав-лення аґару, охолоджували до 37°С і п