РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Работа была выполнена в 1997-2001 гг. в лабораториях изучения инфекционных
болезней молодняка, вирусологии и биохимии института экспериментальной и
клинической ветеринарной медицины УААН, а также в животноводческих хозяйствах
Украины: КСП “Безлюдовка”, Харьковского района, Харьковской области, КСП
"Новолипецкий" Харьковского района, Харьковской области, СПК “Червоний
партизан", Харьковского района, Харьковской области, КСП “Рассвет”
Балаклеевского района, Харьковской области, опытном хозяйстве "Украинка
Слобожанская" Харьковского района, Харьковской области, КСП “Нива”
Дергачевского района, Харьковской области, КСП “Слатинское” Дергачевского
района, Харьковской области, КСП “Шевченковский” Дергачевского района,
Харьковской области, АО “Промiнь”, г. Золочева, ООО "Россия", Волновахского
района, Донецкой области, ООО "Новогригорьевское" Юрьевского района,
Днепропетровской области, СООО "Деснянське", Будского району, Сумской области.
2.1 Штаммы бактерий, питательные среды, способы культивирования бактерий,
получение антигенов
Культивирование и хранение производственных и полевых культур Е.со1i проводили
с использованием следующих питательных сред: бульон Хоттингера, МПА, МПБ, агар
Эндо, приготовление которых осуществлялось в секторе питательных сред ИЭКВМ, в
соответствии с общепринятыми методиками.
Лабораторную диагностику колибактериоза новорожденных телят проводили в
соответствии с "Настановою з лабораторної діагностики ешерихіозу
/колібактеріозу/ тварин", утвержденной начальником Управления ветеринарной
медицины и Государственной ветеринарной инспекцией Министерства сельского
хозяйства и продовольствия Украины П.П.Достоевским 22 февраля 1996г.
(регистрационный номер 15-14/6).
Наличие адгезивных антигенов у выделенных культур эшерихий определяли в
капельной РА с помощью моноспецифических сывороток в соответствии с
"Методическими рекомендациями по определению адгезивных антигенов К99, F41,
Att25 у патогенных эшерихий и выявлению у них антиадгезивных антител у КРС"
/1989 г/.
Определение ЛД50 и ЛД100 E.coli 866 проводили по методике Г.Ф. Лакина.
Вирулентные свойства культур Е.со1і определяли путем внутрибрюшинной инокуляции
различных доз суточной агаровой культуры белым мышам, массой 16-18 г. Культуры,
вызывающие гибель мышей в дозе 108 –5.108 микробных тел, считали вирулентными.
Вакцина против колибактериоза молодняка на основе факторов патогенности
возбудителя (ТУУ 46.15.042-94) изготовлялась в лаборатории изучения
бактериальных болезней молодняка. При этом использовали 7 штаммов
Е.со1i-продуцентов фимбриальных адгезинов К99, F41, Att25, 987P, K88ab, K88ac,
K88ad (№№ 957, 688, 4, 661/7, 745, 729, 798) и 2 штамма-продуцента
термолабильного (№866) и термостабильного №60 энтеротоксинов.
Для контрольного заражения лабораторных животных использовали контрольные и
эпизоотические вирулентные штаммы Е.со1i с различными типами фимбриальных
адгезинов (из коллекции лаборатории изучения болезней молодняка)
Уровень накопления бактериальной массы Е.со1i при культивировании на различных
питательных средах контролировали по оптическим стандартам мутности, а также
фотометрически по длине волны.
Получение субклеточных антигенов фимбрий эшерихий при изготовлении вакцины
"Рококол" для оральной иммунизации новорожденных телят против колибактериоза и
рота-, коронавирусных инфекций осуществляли с использованием следующей
методики:
Бактериальную суспензию адгезивных штаммов Е.со1i в фосфатно-мочевинном буфере
нагревали на водяной бане при 700-800С, в течение 20 минут, после чего
микробную массу удаляли центрифугированием, а супернатант использовали в работе
(Jacobs A., de Graaf F., 1985).
Получение энтеротоксинов термолабильного энтеротоксина (ТЛЭ) и термостабильного
энтеротоксина (ТСТ) осуществляли путем культивирования энтеротоксигенных
эшерихий в жидких питательных средах с последующим удалением бактериальной
массы центрифугированием (Ковальчук Н.М. и соавт., 1983; Гнатенко Г.В. и соавт,
1990).
В качестве метода стандартизации фимбриальных адгезинов эшерихий использовали
развернутую реакцию агглютинации с моноспецифическими антиадгезивными
сыворотками и реакцию маннозорезистентной агглютинации. При этом
стандартизируемые культуры должны давать агглютинацию в разведении не менее
1:1280 при постановке развернутой реакции агглютинации и 1:16 в реакции
маннозорезистентной агглютинации. Для стандартизации энтеротоксинов эшерихий
культуральную жидкость, полученную с помощью метода извлечения
токсиносодержащего материала посредством глубинного культивирования
(Методические рекомендации по получению, очистке энтеротоксинов эшерихий и
изготовлению антитоксических сывороток, Харьков, 1993), вводят внутрибрюшинно
мышам в дозе 0,5 мл. При этом должны погибнуть 100% мышей.
Определение адгезивной активности Е.со1i на микро ворсинках эпителиоцитов
кишечника мышей проводилось по методу Зарозы В.Г. (1991, стр. 155). Перед
постановкой метода предварительно получали микро ворсинки тонкого кишечника по
следующей схеме:
1) вырезали сегмент тонкого кишечника только что убитой мыши и помещали в буфер
Кребса (0,12 NaCL, 0,014M KCL, 0,025 M NaHCO3 и 0,001 M NaHPO4) c pH 7,2 при
температуре 40С;
2) разрезали кишечник вдоль и тщательно промывали его буфером Кребса при 40С;
3) осторожно соскабливали слизистую оболочку покровным стеклом, отделяя таким
образом микро ворсинки в холодном буфере Кребса;
4) после осаждения микро ворсинок, их тщательно промывали холодным буфером
- Київ+380960830922