РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Настоящая работа выполнена в 2002-2005 гг. на кафедре эпизоотологии, паразитологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Южного филиала "Крымский агротехнологический университет" Национального аграрного университета, в отделе по диагностике и мерам борьбы с лейкозом Республиканской государственной лаборатории ветеринарной медицины Автономной Республики Крым (филиал кафедры), а также в неблагополучных по лейкозу крупного рогатого скота животноводческих хозяйствах Автономной Республики Крым.
Ряд серологических исследований проводились в лаборатории медленных инфекций Национального научного центра "ИЭКВМ" (заведующий лабораторией, кандидат ветеринарных наук С.К. Горбатенко) и в лаборатории лейкозов Института эпизоотологии Украинской Академии аграрных наук. Научно-производственные опыты проводились в базисных животноводческих хозяйствах Симферопольского района АРК: ООО "Пригородное", ОАО "Широкое", АПК "Степь", ООО "Гвардейское", ООО "Новая волна", ОАО "Партизан", ОАО "Родина". В научных опытах по изучению особенностей эпизоотического и инфекционного лейкозного процесса использовали 38 телят и 118 коров красной степной породы с различным уровнем примеси крови англерского скота. Проведен анализ результатов исследований более 11000 проб сывороток крови крупного рогатого скота в реакции иммунодиффузии с лейкозным антигеном в геле агара.
При решении поставленных задач на первом этапе исследований использовали материалы ветеринарной отчетности Управления ветеринарной медицины в АР Крым и Республиканской государственной лаборатории ветеринарной медицины АР Крым. Сбор данных о регистрации и распространении лейкоза крупного рогатого скота проводили в четырнадцати районах и двух зонах АР Крым. Глубина ретроспективного анализа составила двенадцать лет (1994-2005 гг.).
При изучении эпизоотической ситуации использовали комплексный эпизоотологический метод, придерживаясь "Рекомендаций по методике эпизоотологического исследования" [182] и "Ветеринарной географии (картографии)" [183]. Особенности распространения инфекции ВЛКРС и клинико-гематологического проявления болезни в обозначенных районах и зонах устанавливали путем определения относительных показателей: уровень интенсивности инфицированности ВЛКРС и заболеваемость животных лейкозом (в процентах), а также индекс эпизоотичности, показатель неблагополучия, напряженность эпизоотической ситуации.
Индекс эпизоотичности () определяли по формуле:
, (2.1)
где -годы регистрации болезни;
-число лет наблюдений.
Показатель неблагополучия () определяли по формуле:
, (2.2)
где -количество неблагополучных хозяйств на территории района;
-число хозяйств на территории района.
Напряженность эпизоотической ситуации () определяли по формуле:
, (2.3)
где - индекс эпизоотичности;
- показатель неблагополучия [184, 185].
В работе, кроме эпизоотологических методов, применяли гематологические, серологические и биохимические методы исследования. Гематологические исследования проводили с использованием метода определения общего количества лейкоцитов, подсчета абсолютного количества лимфоцитов в 1 мкл крови, который проводили с использованием камеры Горяева под световым микроскопом с применением фазово - контрастного устройства (КФ-4). Гематологические изменения у животных оценивали по "лейкозному ключу" (таблица 2.1). Инфицированность животных ВЛКРС устанавливали выявлением специфических антител с помощью реакции иммунодиффузии (РИД) и реакции иммуноферментного анализа (ИФА).
Таблица 2.1
Лейкозный ключ, используемый при гематологическом исследовании
Возраст, летЖивотныездоровыеподозреваемые в заболеваниибольныеколичество лейкоцитовабсолютное количество лимфоцитовабсолютное количество лимфоцитовОт 2 до 4До 11000От 8000 до 10000Свыше 10000От 4 до 6До10000От 6500 до 9000Свыше 9000От 6 и старшеДо 9000От 5500 до 8000Свыше 8000
Реакцию иммунодиффузии ставили согласно "Методическим указаниям по диагностике лейкоза крупного рогатого скота", утвержденным ГУВ МСХ СССР в 1985 году. В качестве исследуемого материала использовали сыворотку крови животных, сыворотку молозива и молока коров, которую получали путем добавления к 50 мл молозива и молока 5 мл 1%-ного раствора пепсина медицинского с последующей выдержкой в теплом месте до образования сгустка и отделения сыворотки.
При постановке РИД использовали следующие диагностические наборы биофабричного производства: "Набор для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота" производства Курской биофабрики и "Набор компонентов жидких стабилизированных для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота в реакции иммунодиффузии (РИД)", ИЭКВМ ГП "Ветеринарная медицина", г. Харьков. Реакцию ставили общепринятыми методами на предметных стеклах с использованием прямоугольного штампа. Антиген и заведомо положительную контрольную сыворотку вносили поочередно в центральные лунки, а исследуемые сыворотки - в свободные периферические лунки. Каждый реагент вносили отдельными пипетками по схеме, изображенной на рисунке 2.1.
Рис. 2.1. Схема заполнения лунок в геле агара: КС - заведомо положительная контрольная сыворотка; АГ - антиген; №№ 1-12 - исследуемые сыворотки.
Оценку результатов иммунодиффузии проводили через 48-72 часа. Для этого предметные стекла с реагентами просматривали в лучах света от осветителя ОИ-19, ОИ-24 с синим светофильтром. Результаты реакции иммунодиффузии с исследуемыми сыворотками оценивали в сравнении с результатами реакции антигена и контрольной сыворотки. Реакцию с исследуемыми сыворотками оценивали как позитивную и негативную, с учетом того, что позитивная реакция с исследуемой сывороткой характеризуется образованием линии преципитации, обозначенной между лунками с антигеном и контрольной сывороткой (рис. 2.2, лунка 1). Сплошная линия преципитации между лунками с анти