РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об'єкти досліджень
Об'єктами досліджень були рослини озимої пшениці сортів Київська 8, Подолянка, Колумбія, Білоцерківська напівкарликова; квасолі сорту Лопата та гібриду кукурудзи Комета МВ.
Польові дрібноділянкові досліди проводили на полях науково-виробничого відділу ІФРГ НАН України, смт Глеваха, Васильківського району Київської області. Площа дослідної ділянки - 12,5 м2 (2,5 м ? 5 м), повторність - чотириразова, ділянки розміщено рендомізовано. Для обробки посівів розчинами препаратів використовували обприскувач марки Агрітоп (інтегральний штанговий; ширина штанги - 2,5 м; кількість розпилювачів - 5; відстань між розпилювачами - 50 см; висота руху штанги (відстань до цільового об'єкту) - 50 см; швидкість руху - 5 км/год. Обприскування проводили у фазу виходу в трубку [82].
У дослідах використовували екстракт вермикомпосту, отриманий за технологією агрофірми "Гермес" (Україна) [129]. З цією метою наважку біогумусу, відповідно до рекомендацій (1 кг біогумусу/3 літри води), суспендували у дистильованій воді для відокремлення бактеріальної суспензії та водорозчинних речовин. Водну витяжку зливали в окрему посудину, а до осаду біогумусу додавали 0,5 N розчин лугу із розрахунку 1 ваг.ч. біогумусу/3 об.ч. 0,1 N розчину NaOH. Суміш залишали 30 хвилин для одержання лужного гідролізату. Після відокремлення, лужний гідролізат нейтралізували за допомогою 5 N розчину лимонної кислоти до значення рН 7,0, яке є оптимальним для збереження активності біологічно активних речовин та життєздатності сапрофітної мікрофлори, після чого змішували його з водним екстрактом. Для отримання препарату, умовно названого "біовітрекс", водну витяжку і гідролізат вермикомпосту змішували в пропорціях 1:1, та концентратом мікроелементів. Для отримання концентрованого розчину мікроелементів солі відповідних металів розчиняли в аліквоті дистильованої води у наступній послідовності: Cu2+, Zn2+, Mn2+, Fe3+, з метою отримання відповідних концентрацій іонів у комплексному регуляторі росту: 0,2-0,3 мас.%,
0,4-0,5 мас.%, 0,4-0,5 мас.%, 0,4-0,5 мас.%.
2.2. Методи досліджень
Активність водних витяжок вермикомпосту визначали в лабораторних умовах за допомогою специфічних біотестів.
Для визначення ауксинової активності використовували відрізки колеоптилів пшениці (сорт Київська 8) [8] та живці квасолі сорту Лопата.
Насіння пшениці промивали, стерилізували 70% етиловим спиртом, замочували в кюветах і ставили для пророщування в термостат за температури +24?C. 3-х добові етиольовані паростки пшениці використовували для біотесту. Для цього брали 5 мм відрізки колеоптилів і розкладали в чашки Петрі (? 35 мм) по 10 штук. Об'єм досліджуваних (приготовлених на дистильованій воді) розчинів становив 2 мл. Як позитивний контроль використовували розчини ІОК в концентраціях 10-4 М і 10-5 М.
Насіння квасолі витримували в кюветах на зволоженому фільтрувальному папері в термостаті при 22-24?С до появи сходів. Подальше вирощування паростків здійснювали на денному світлі до появи 2-х справжніх листків, яке наступало на 9-й день після початку досліду. Живцювання проводили за методом Турецької [124, 125]. Живці витримували у розчинах препарату - водної витяжки біогумусу, лужного гідролізату, суміші водної витяжки і лужного гідролізат біогумусу (1:1), та, для порівняння, ІОК (10-5 М), протягом 24 год., промивали дистильованою водою і переносили в колби з тією ж водою для подальшого укорінення. На 21-у добу підраховували кількість та загальну масу коренів в ризо генній зоні гіпокотиля (5 см).
Для визначення цитокінінової активності в якості біотесту використовували ізольовані сім'ядолі огірка [83] сорту Ніжинський. 7-денні паростки огірків, вирощені в термостаті (за температури +28?С) в темряві. При слабкому розсіяному освітленні сім'ядолі відділяли від паростків, зважували, підбираючи вирівняні за масою проби в кожній повторності. Сім'ядолі розкладали в чашки Петрі, де містились аліквоти (2 мл) водних розчинів препаратів. Зразки витримували в термостаті за тієї ж температури протягом доби. Після закінчення експозиції сім'ядолі підсушували фільтрувальним папером і зважували. Зміни в масі сім'ядолей виражали в процентах приросту до відповідної маси в контрольному варіанті [115]. Як позитивний контроль використовували розчин БАП в концентраціях 10-4 М і 10-5 М.
Для визначення гіберелінової активності використовували гіпокотилі паростків огірка сорту Ніжинський [90]. 3-4-денні паростки огірків, вирощували в термостаті (за температури +28?С) в темряві. Для подальшого аналізу відбирали приблизно однакові паростки, які розкладали в чашки Петрі, де містились аліквоти (2 мл) водних розчинів препаратів. Зразки витримували в термостаті за тієї ж температури протягом доби. Після закінчення експозиції гіпокотилі вимірювали. Зміни довжини гіпокотилей виражали в процентах приросту до відповідної маси в контрольному варіанті. Як позитивний контроль використовували розчин ГК в концентрації 10-5 М.
Для визначення вмісту фітогормонів (ІОК, АБК, зеатину, зеатин-рибозиду) у водних витяжках вермикомпосту проводили попереднє очищення екстрактів на ділильних лійках методом перерозподілу фітогормонів у двох фазах розчинників, які не змішуються між собою: діетиловому ефірі (для ауксинів), рН 3,0 та н-бутанолі (для цитокінінів), рН 8,0 [83].
Для визначення вмісту фітогормонів застосовували метод кількісної спектроденситометричної тонкошарової хроматографії [114]. Відцентрифуговані екстракти упарювали під вакуумом при 40-45оС. Сухий залишок розчиняли в 1 (1,5) мл етанолу, переносили в епіндорфи і знову центрифугували.
Попереднє очищення і концентрування фітогормонів проводили на пластинках із силікагелем марки "Silufol UV254" ("Chemapol", Чехія) у суміші розчинників, застосованих послідовно: хлороформ, 12,5 %-ний аміак, етилацетат:оцтова кислота (20:1). Очищені таким чином екстракти цитокінінів та індольних сполук розділяли на плас