РОЗДІЛ 2
ОБ’ЄКТИ, УМОВИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об’єкти досліджень та їх характеристика
Як основні об’єкти досліджень використовували відрізки колеоптилів та
етіольовані проростки озимої м’якої пшениці (Triticum aestivim L.) сорту
Донецька 48. Крім того, в окремих експериментах використовували сорти пшениці
Донецька 46, Харківська 81 та Харківська 96. Частину експериментів проводили на
етіольованих проростках ярого ячменю (Hordeum vulgare L. – сорт Козак) та
ізольованих сім’ядолях огірка (Cucumis sativum L. – сорт Джерело).
Вибір етіольованих проростків або їх частин як об’єктів досліджень зумовлений
складністю регуляції про-/антиоксидантної рівноваги в зелених частинах рослин.
Електрон-транспортний ланцюг хлоропластів – одне з потужних джерел утворення
АФК [127, с. 42-43; 144, с. 27]. За високої концентрації кисню в тканинах
штучні антиоксиданти, які використовуються в експериментах, можуть втрачати
властивості антиоксидантів і ставати продуцентами О2 ? [6]. Так, показано, що
при вирощуванні проростків пшениці за нормального освітлення антиоксидант іонол
втрачає здатність знижувати генерацію АФК проростками [6].
При інкубації зелених частин рослин на світлі можливе посилення
фотопереокиснення ліпідів й істотні флуктуації вмісту продуктів ПОЛ в тканинах
[143]. Зважаючи на ці обставини, ми прагнули дотримуватися суворої етіоляції
об’єктів дослідження, принаймні на стадіях відбору матеріалу для біохімічних
аналізів.
Проводячи дослідження на прикладі незелених частин рослин, ми виходили з
відомостей про значний вклад в утворення АФК електрон-транспортних ланцюгів
мітохондрій, плазмалеми, а також ферментів, локалізованих в клітинних стінках
[224, 380]. Як свідчать літературні дані, в цих компартментах за природних й
експериментальних умов можуть генеруватися різні АФК і розвиватися прояви
окиснювального стресу [145, 185, 193]. При цьому незелені органи рослин,
наприклад, корені та колеоптилі, а також інтактні етіольовані проростки можуть
бути чутливими моделями для створення експериментального окиснювального стресу
[57, 145, 193].
Ще однією причиною вибору проростків та їх органів як об’єкта досліджень була в
цілому недостатня вивченість механізмів стійкості ювенільних рослин до
абіотичних стресорів [55]. При цьому значимість цього періоду для
продуктивності рослин безсумнівна.
Значна частина експериментів з вивчення впливу екзогенних індукторів утворення
АФК та антиоксидантів на стійкість рослинних тканин до абіотичних стресорів
була проведена на прикладі відрізків колеоптилів пшениці. Вони складаються з
гомогенної тканини, яка зручна для хімічного аналізу. При цьому відрізки
колеоптилів впродовж кількох діб можуть культивуватися на поживному розчині, що
містить сахарозу [179]. В них добре надходять екзогенні сполуки, дія яких
вивчається. При використанні ізольованих органів не виникає проблем, пов’язаних
з транспортом метаболітів та екзогенних сполук з одних органів в інші.
Водночас, незважаючи на активне використання даної моделі для різноманітних
фізіологічних досліджень, за певних обставин не виключені труднощі в
інтерпретації результатів, отримуваних з її використанням. Так, впродовж
певного часу можлива загибель колеоптилів за сценарієм апоптозу. Проте виразні
явища апоптозу (фрагментація ДНК, зменшення вмісту білка, утворення вакуолярних
везикул тощо) в колеоптилях пшениці спостерігалися на 8-му добу при вирощуванні
проростків за температури 26°С [6, 195]. Для уповільнення процесів, що
передують програмованій загибелі колеоптилів, ми пророщували насіння й
інкубували ізольовані колеоптилі за зниженої температури (18-20єС) і в усіх
експериментах мали обов’язковий контрольний варіант, зразки якого не зазнавали
впливу стресорів та досліджуваних сполук. Колеоптилі цього варіанта не втрачали
життєздатності протягом не менше 10 днів з моменту початку пророщування
насіння. Експерименти з колеоптилями закінчували на 6-7 добу. В період
спостережень в цьому контрольному варіанті оцінювали ті ж біохімічні параметри,
які визначали у дослідних варіантах. Необхідно наголосити, що в цей період не
спостерігалося змін показників, які могли б свідчити про початок апоптозних
явищ. Так, за час експерименту не відбувалося істотного зниження вмісту білка в
колетилях (див. рис. 3.9), у контрольному варіанті не спостерігалося
достовірного посилення генерації АФК (див. рис. 3.4 і 3.6) та підвищення вмісту
продуктів ПОЛ (рис. 3.5), що може передувати апоптозу [195]. Таким чином,
колеоптилі, за дотримання певних умов, можуть бути моделлю для дослідження
механізмів індукування стійкості рослин до дії стресорів. Іншим об’єктом
дослідження були ізольовані сім’ядолі огірка. Ця модель є чутливою до
екзогенних цитокінінів, АБК, а також інших сполук [10]. Її перевагою є те, що
життєздатність сім’ядолей визначається клітинними механізмами резистентності,
оскільки поділ клітин сім’ядолей припиняється на п’яту добу росту [10].
Зважаючи на те, що ізольовані органи являють собою хоча й цікаву, але штучну
рослинну модель, частину експериментів проводили на інтактних етіольованих
проростках озимої м’якої пшениці та ярого ячменю. Ці об’єкти, зокрема, успішно
використовувалися іншими авторами в експериментах з дослідження дії про- і
антиоксидантів на процеси апоптозу [6, 57], вони є також чутливими до дії
гормоноподібних сполук [190].
2.1.1. Підготовка об’єктів досліджень до експериментів. Насіння озимої пшениці
(сорти Донецька 46, Донецька 48, Харківська 81, Харківська 96) або ярого ячменю
(сорт Козак) знезаражували 5%-ним пероксидом водню протягом 20 хв, ретельно
промивали проточною дистильован
- Київ+380960830922