ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Химическое строение регуляторов роста. В процессе биологического скрининга было отобрано 5 соединений, производных пиридина, пиримидина, ацетофенона, мочевины, а также фосфорсодержащего химического соединения как перспективных заменителей фитогормонов: ивин (N-оксид 2,6-диметилпиридина), метиур (Na-производное 6-метилтиоурацила), соединения Д-107 (1-ацетиламино-1-aцетилтио-2-oксо-2-фенилэтан), №2622 (N-диметил-N?-[3-хлор-сульфоланил-4] тиомочевина) и триамелон - (иодид трис (2,2-триметиламмонийметил фосфат).
Химическое строение указанных соединений представлено на схеме 1:
ивин - ИОХ ивин-х - ИОХ
ивин-ян - ИОХ Д-107 - ИБОНХ
метиур - ИБОНХ триамелон - ИОХ
2.2. Растительный материал. В опытах in vitro использовали табак Nicotiana tabacum (штаммы SR-1; SR-2, visconsinia); картофель Solanum tuberosum (сорта Зарево и Невский) и томаты 2-х видов: культурный вид (Lycopersicon esculentun) мутантной линии МО 393 и дикий вид Перувианского томата (L.peruvianum var. dentatum 3767). Для получения каллуса использовали сегменты (размером 1,5 ? 0,5 см) листьев и стеблей растений.
Перед введением в культуру листовой или стеблевой тканей растений для их стерилизации использовали диоцид (или гипохлорит натрия) и 70 %-ный этанол с последующей промывкой тканей стерильной дистиллированной водой.
В опытах in vivo использовали семена спаржевой фасоли (Phaseolus vulgaris L.) сорта Белозерная. Проращивание семян проводили во влажной среде в специально подготовленных для этого лотках в термостате при 25-26 0С в течение 2-3-х суток; затем проросшие семена помещали в световой блок. Вегетация растений происходила при освещении 4000-6000 люкс в течение недели при температуре 22-24 0С и 16-ти часовом световом дне. Для определения ауксиновой активности использовали метод Р. Х. Турецкой [16]: для экспериментов использовали черешки 12-14-дневных растений фасоли и помещали их в водные растворы испытуемых рострегуляторов. В каждом случае закладывали 2 параллельных опыта, по 5 черешков на каждый.
В молекулярно-биологических экспериментах для выделения белков и РНК использовали изолированные зародышевые оси семян фасоли. Простерилизованные этанолом семена проращивали в термостате между влажными листами фильтровальной бумаги (пропитанной либо дистиллированной водой, либо 0,0002%-ными растворами регуляторов роста) при температуре 260С в течение 2-х суток. После инкубации зародышевые оси отделяли от семядолей, промывали дистиллированной водой и разделяли поровну (по 100 шт.) на 2 порции: для выделения белков и РНК.
В опытах по изучению прямого действия синтетических рострегуляторов на рост эмбрионов изолированные зародышевые оси инкубировали между листками фильтровальной бумаги, пропитанной либо дистиллированной водой (контроль), либо водными растворами активаторов роста: N-окисью лутидина (ивин-ян) или 6-метилтиоурацилом (метиур), или водным раствором ауксина ИУК в концентрациях соответственно 1 мг/л. Инкубацию проводили в термостате в темноте при 260 С на протяжении 72-х часов. С целью "подкормки" зародышевых осей к исходу вторых суток во все пробы добавляли смесь аминокислот гидролизата белка казеина и глюкозу соответственно до конечной концентрации раствора 0,002 %.
Для одной серии опытов брали отделенные от семядолей целостные зародышевые оси, т.е. содержащие полный набор первичных органов (корень, гипокотиль и лист), для другой - "декапитированные", т.е. с удаленной верхушечной элонгирующей зоной роста, из которой, по аналогии с колеоптилями [47], может осуществляется поступление фитогормона в нижележащую часть зародыша - гипокотиль.
2.3. Культуральные среды для тканей растений. Применяли питательные среды: RMKU, RMNO, RMP, RMOP, RМВ, RMO, NР, Rmmin, BK, NT (Нагаты и Такебе), LS (Линсмайера и Скуга), ST (Шепарда и Тоттена) и Р, являющиеся модификациями среды МS (Мурашиге и Скуга). Наименования и состав перечисленных сред взяты из [15]. Все выше перечисленные среды были модифицированы нами путем замены в них ауксинов или цитокининов на синтетические соединения, которые были отобраны в качестве заменителей этих фитогормонов.
Для приготовления питательных сред использовали концентрированные исходные (маточные) растворы: 1) 10-кратный раствор макросолей; 2) 100-кратный раствор микрослей (при этом растворы солей СоСI2.6Н2О и СuSO4.5Н2О готовили отдельно - по 25 мг каждой соли последовательно растворяли в 10 мл воды, после чего их объединяли с раствором остальных микросолей. Общий объем доводили до 100 мл); 3) исходный раствор Fe-хелата готовили путем последовательного растворения 7,45 г Na2-ЭДТА и 5,57 г FeSO4?7H2O в воде (конечный объем раствора доводили до 1л с последующим нагреванием до 100 0С). Для приготовления 1 л агаризованной питательной среды брали 100 мл исходного раствора макросолей, 10 мл раствора микросолей, 5 мл Fe-хелата и соответствующее количество агара, витаминов, гормонов, углеводов и т.д. Растворы витаминов готовили непосредственно перед работой, ауксины растворяли предварительно в небольшом количестве этанола и доводили водой до необходимого объема при подогревании; растворы цитокининов готовили путем растворения их в небольшом объеме 0,5 н HCl при подогреве с последующим доведением водой до требуемого объема. Агаризованные среды (6-8 г/л агара), доведенные до определенного значения рН, автоклавировали. Изолирование и культивирование мезофильных протопластов из листовых дисков табака было проведено в соответствии с методом, приведенным в протокольной части монографии [ 15 ].
2.4. Молекулярно-биологический анализ продук