Розділ 2
об’єкти та методи досліджень
Представлений у дисертації експериментальний матеріал одержано в процесі
досліджень, які проводили у 2001–2003 роках у відділі симбіотичної
азотофіксації Інституту фізіології рослин і генетики НАН України.
Об’єкти досліджень
У дослідженнях використовували люпин жовтий (Lupinus luteus L.) сорту Промінь,
сою (Glycine max Merr.) сорту Мар’яна, яка здатна утворювати бульбочки у
симбіозі з азотфіксувальними бактеріями (нодулююча), безбульбочкову ізолінію
сої (Glycine soja L.) сорту Лі (ненодулююча) та комерційний лектин звичайної
сої (“Лектинотест”, Львів).
У роботі також використовували штами 359а та 400повільнорослих бульбочкових
бактерій Bradyrhizobium sp. (Lupinus) та штами 631 і 634б Bradyrhizobium
japonicum, з колекції Інституту фізіології рослин і генетики НАН України, а
також штам Bradyrhizobium japonicum 2110, одержаний з Інституту мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України.
Умови проведення досліджень
Вегетаційні досліди проводили на спеціально обладнаному майданчику Інституту
фізіології рослин і генетики НАН України. Рослини люпину та сої вирощували в
11-кілограмових посудинах Вагнера в піщаній культурі на поживному середовищі
Гельрігеля з 0,25 та 1,0 нормами азоту (Ca(NO3)2 ). Одна норма азоту становить
708 мг Ca(NO3)2x4H2O на 1 кг субстрату. Перед посівом насіння протягом 20 хв
стерилізували 70 %-ним етиловим спиртом і інокулювали згідно схем дослідів
різними штамами роду Bradyrhizobium. Для бактеризації насіння готували інокулят
відповідних штамів. Метод приготування інокуляту описано нижче. В окремих
дослідах контрольні рослини не інокулювали. У посудинах вирощували по 4–6
рослин при 60 %-ній вологості і природньому освітленні. Повторність дослідів
7-кратна. У дослідах здебільшого використовували річковий пісок, промитий
водопровідною водою.
Для обліку кількості бульбочок та їх маси, а також маси коріння і надземних
органів рослин, інтенсивності фіксації азоту та СО2 газообміну рослини
відбирали протягом вегетації у фазах бутонізації, цвітіння та утворення бобів.
Польові досліди проводили в науково–виробничому відділі Інституту фізіології
рослин і генетики НАН України (смт. Глеваха Васильківського району Київської
області). Грунт дослідних ділянок світло-сірий, опідзолений, легкосуглинковий,
рН сол. 5,5–5,8. Вміст гумусу – 1,6–1,8 %, фосфору – 9–10, калію – 7–8,
легкогідролізованого азоту – 10–12 мг/100 г ґрунту. Сою висівали із розрахунку
100 кг/га, ширина міжрядь – 45 см. Повторність дослідів – 5-ти разова, облікова
площа ділянок 2 м2.
У всіх дослідах дотримувались загальноприйнятої агротехніки. Насіння
інокулювали штамом B. japonicum 634б, попередньо проінкубованого протягом 20
год із різними концентраціями лектину. Рослини контрольного варіанта
інокулювали суспензією бактерій, де розчин лектину замінювали водою.
Розміщення дослідних ділянок – рендомізоване.
Методи досліджень
Для приготування інокуляту повільнорослі бульбочкові бактерії вирощували на
манірно-дріжджовому агарі [144] протягом 9–10 діб при 26–28 єС. Культуру
змивали фізіологічним розчином (0,9 % NaCl). Кінцева концентрація бактерій
становила 107 клітин у 1 мл суспензії.
Для вивчення впливу екзогенного лектину на азотфіксувальну активність і
продуктивність рослин сої інокулят готували шляхом інкубації суспензії ризобій
з лектином у різних концентраціях протягом 20 год при температурі 28°С.
Співвідношення об’ємів інкубованих компонентів становило 1:1. Кінцева
концентрація бактерій складала 107 клітин в 1 мл суспензії.
Активність процесу азотофіксації визначали ацетиленовим методом [120]. Коріння
з бульбочками поміщали в герметично закриті скляні флакони ємкістю 75 см3, в
яких створювали 10 %-ну концентрацію ацетилену. Тривалість інкубації – 1
година. Після інкубації газову суміш, яка містила етилен, утворений в
результаті редукції ацетилену нітрогеназою, аналізували на газовому
хроматографі «Chromatograf – 504» (Польща) з полум`яно-іонізаційним детектором.
Розділення газів проводили на колонці (0,40·130 см) із Parapac N при
температурі 80 єС. Газоносієм був азот (50 мл за 1 хвилину). Об’єм аналізованої
проби газової суміші становив 0,5?1 см3. Як стандарт використовували чистий
етилен, одержаний із етилового спирту та концентрованої сірчаної кислоти при
підігріванні до 160 єС:
С2Н5ОН>С2Н4+Н2О
Етилен очищали послідовним пропусканням через концентровану Н2SO4 та 4 н розчин
NaOH і зберігали в газометрі над насиченим розчином NaCl. Ацетилен, який
використовували в дослідах, одержували шляхом дії води на технічний карбід
кальцію:
СаС2+ 2Н2О>С2Н2+Са(ОН)2
з подальшим очищенням утвореного газу завдяки пропусканню його через систему
склянок Дрекселя з розчинами-поглиначами: 1) розбавленою водою сірчаною
кислотою, (3 об’ємні частини на 1 частину води – вилучення ацетону і аміаку);
2) 20%-ним розчином оцтовокислого свинцю або кадмію (вилучення
водень–сульфіду); 3) 20%-ним розчином сірчанокислої міді або солянокислим
розчином сулеми (вилучення фосфіну); 4) активованим вугіллям в U–подібній
трубці (вилучення ацетону); 5) 20%-ним лужним розчином пірогалолу на 20%-ному
розчині гідроксиду калію (вилучення кисню). Одержаний ацетилен зберігали в
газометрах над насиченим розчином хлористого натрію.
Робочу калібрувальну суміш готували розведенням етилену повітрям за допомогою
шприців у такій послідовності:
2 мл С2Н4+ повітря>50 мл>5 мл +повітря >50 мл.
З огляду на молярний обўєм газу ? 22,4 л за нормальних (температура 0єС, тиск
760 мм ртутного стовпа) умов, ? концентрація етилену в такій суміші становить
176,5МF
- Київ+380960830922