РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об'єкт досліджень
Об'єктом лабораторних та польових досліджень були рослини кукурудзи (Zea mays L.) сорту Закарпатська жовта зубоподібна. Це високоврожайний середньопізньостиглий сорт, внесений в Реєстр сортів рослин України, який вирощують на зерно, зелений корм та силос [95]. Окрім того, проростки кукурудзи є модельним об'єктом багатьох лабораторій.
2.2. Схема та методи лабораторних досліджень
У лабораторних умовах насіння кукурудзи викладали в емальовані кювети на скло, обгорнуте фільтрувальним папером і змочене дистильованою водою (контроль), розчинами ацетату свинцю у концентраціях 10-5, 10-4, 10-3 М (дослід). Ацетат свинцю (ІІ) є однієн з небагатьох добре розчинних солей свинцю, що широко використовується у лабораторній практиці [16]. Кювету накривали склом і витримували у темряві в термостаті при температурі 240С. Тридобові етіоловані проростки переносили на розчини ацетату свинцю у концентраціях 10-5 та 10-3 М. За контроль слугували рослини кукурудзи, вирощені на дистильованій воді без додавання ацетату свинцю. Схему досліду представлено на рис. 2.2.1. Для дослідження післядії токсичних іонів частину пророщених на розчинах ацетату свинцю проростків переносили на дистильовану воду. Для забезпечення сталого іонного складу розчини замінювали кожні 2 доби. Проростки вирощували у контрольованих умовах освітлення (2,0 - 2,2 тис. лк), температури (20-25°С) та 14-годинному фотоперіоді [49]. Для аналітичних та гістохімічних досліджень використовували 10-добові проростки кукурудзи.
Рис. 2.2.1. Схема лабораторних досліджень.
- середовище пророщування, тривалість 3 доби
?- середовище вирощування, тривалість 7 діб
2.2.1. Визначення індексу толерантності
Рівень стійкості проростків кукурудзи до впливу свинцю перевіряли використовуючи тест Вількінса [317, 140]. Вимірювали ріст коренів у середовищі з свинцем і без свинцю. Індекс толерантності розраховували у процентах як відношення середньої довжини коренів рослин, які росли на середовищі із свинцем, до середньої довжини коренів контрольних рослин [228, 264, 316].
2.2.2. Визначення інтенсивності люмінесценції калози
Люмінесцентні властивості листків часто використовуються для діагностики стану рослин [135]. Для досліджень використовували 10-добові рослини кукурудзи. Поперечні зрізи осьових органів робили на відстані 1-2 мм від кінчика кореня та на відстані 1-2 мм вище кореневої шийки. Свіжі зрізи зафарбовували протягом 10 хвилин свіжоприготованим 0,005% розчином анілінового синього у 0,15 М розчині К2НРО4 (рН 8,2) [40]. Зафарбовані аніліновим синім зрізи розглядали під люмінесцентним мікроскопом ЛЮМАМ - Р3 (Ленінград, СРСР). Інтенсивність люмінесценції зафарбованої аніліновим синім калози визначали на цитофлуориметрі ЛЮМАМ - Р3 (Ленінград, СРСР) [10, 38]. Люмінесценцію збуджували синім світлом. Для цього із світлового потоку ламп надвисокого тиску ДРШ 250 виділяли світлофільтром ФС-1+СС-15 світло в межах ?=380-420 нм. Інтенсивність флуоресценції вимірювали, використовуючи світлофільтр ?max=530±14 нм [8]. Кожен дослід проводили тричі та робили по 20-30 вимірів інтенсивності люмінесценції калози.
2.2.3. Визначення вмісту хлорофілів і каротиноїдів
Вміст хлорофілів та каротиноїдів визначали спектрофотометрично. Свіжі листки 10-денних рослин кукурудзи розтирали у етиловому ефірі з додаванням СаСО3. Гомогенат кількісно переносили у пробірки та центригували 3 хвилини при 12000 об. на мікроцентрифузі типу 320. Для подальших досліджень використовували надосадовий розчин. Екстинцію розчинів вимірювали при довжинах хвиль 662, 644 та 440,5 нм на спектрофотометрі Cary 50 Bio UV-Visible. Концентрацію пігментів розраховували за рівняннями Сміта-Бенітея [78].
2.2.4. Розділення пігментів методом HPLC
Паралельно проводили розділення пігментів методом високоефективної газово-рідинної хроматографії (HPLC) [309]. Заморожені у рідкому азоті 10-добові листки рослин кукурудзи розтирали з додаванням СаСО3 у сольвенті А, що містив ацетонітрил, метанол, дистильовану воду у об'ємних частках 72:8:1. Гомогенат кількісно переносили у центрифужні пробірки та центрифугували 3 хвилини при 12000 об. на мікроцентрифузі типу 320. Для подальших досліджень використовували надосадовий розчин [174]. Пігменти розділяли на колоні RP-18 (Nucleosil gel, 250x4 mm, 5µm, TECNOCROMA, Барселона, Іспанія), при пропливі сольвенту А 2 мл/хв. Абсорбцію пігментів вимірювали при 440 нм, використовуючи детектор UV-970, (Jasco Corporation, Токіо, Японія) [183]. Площу поверхні під піками вираховували за допомогою програми Program Borwin Chromatography (Software, Version 1,20, YMBS, Le Fontanie, Франція). Деепоксидаційний статус пігментів віолаксантинового циклу розраховували як відношення суми антераксантину та зеаксантину до суми віолаксантину антераксантину та зеаксантину у відсотках [308].
2.2.5. Визначення активності карбоангідрази
Активність карбоангідрази визначали за методом Уілбурга-Андерсена, описаному у статті А.В. Косіцина та Т.І. Ігошиной [1986]. Свіжоізольовані органи 10-добових проростків кукурудзи розтирали в охолодженій ступці в 1,5 М трис-аскорбатному буфері (рН 8,2) у співвідношенні наважки рослин до об'єму розчину 1:5. Гомогенат центрифугували. Надосадовий розчин використовували для визначення активності ферменту. Для цього до 1,0 мл екстракту додавали 2,0 мл охолодженого і насиченого СО2, розчину реакційної суміші, яка містила 2,0 мл 2,5 мМ вероналового буферу рН 8,2 і 0,001 бромтіоловий синій при температурі близькій до 2°С. Одночасно із внесенням екстракту включали секундомір і фіксували час, за який змінювався колір суміші зі синього до зелено-жовтого.
Розрахунок активності карбоангідрази проводили за формулою:
Vs=((Te/Tn-1) x 10)/г сирої маси, де
Te- тривалість реакції у контролі (с),
Tn- тривалість реакції у досліджуваних зра