РОЗДІЛ 2
ОБ'ЄКТИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1 Об'єкти досліджень
Об'єктами досліджень були проростки гороху посівного Pisum sativum L. сорту Норд, сої культурної Glycine max (L.) Merr. сорту Аметист і кукурудзи звичайної Zea mays L. гібриду Дніпровський 310, які вирощували на дистильованій воді, що містила іони Cd2+ і Ni2+ у концентраціях 10-5М (максимальна), 10-6М (мінімальна) для Cd і 10-4М (максимальна), 10-5М (мінімальна) для Ni. Оскільки для рослин кукурудзи концентрація іонів Ni2+ 10-4М виявилась летальною, то для цієї культури використовували наступні концентрації Ni2+ 2*10-5М (максимальна) і 10-5М (мінімальна). В якості джерел важких металів використовували CdSO4, CdCl2, NiSO4 і Ni(NO3)2. Для проростання насіння замочували на 36 годин при температурі +27-28оС і далі переносили у вегетаційні пластикові посудини на зазначений вище розчин важких металів. Рослини вирощували при природному рівні освітленості і температурі +25оС.
2.2 Методи досліджень
Для вивчення дії Cd і Ni на ріст і розвиток проростків і біохімічних процесів, що протікають у них, використовували наступні методики.
Визначення біоморфометричних показників проводили відповідно до загальноприйнятих методів [4, 18]. Індекс толерантності (ІТ) розраховували за формулою:
Розрахунок індексу ростового інгібування проводили згідно методу L.Leita [145]:
де mk - маса контрольної рослини (органа рослини) (г), m - маса рослини (органа) у присутності токсикантів (г).
Кореневий індекс (КІ) розраховували згідно методу D.Wilkinson [207], за формулою:
де Lme - приріст коренів на розчині з важким металом (см), Lc - приріст на контрольному розчині (см).
Вміст Cd і Ni у рослинному матеріалі визначався з використанням методичних вказівок щодо визначення важких металів у ґрунтах сільськогосподарських угідь і продукції рослинництва [33]. Мінералізація рослинних проб проводилася методом сухого озолення за ДСТ 26657-85 [8] до повного озолення рослинного матеріалу. Кислотна екстракція виконувалася з використанням азотної кислоти (розведення 1:1). Подальше визначення концентрації важких металів проводилося з використанням атомно-адсорбційного спектрофотометра С-115 (Україна). Розрахунки показників внутрішньотканинного забруднення рослин проводили за формулою:
Концентрація відновленої форми глутатіону визначалася за модифікованим нами методом E.Beutler [67]. В основі методу лежить здатність SH-групи відновленого глутатіону реагувати з 5,5-дітіобіс-2-нітробензойною кислотою (реактив Елмана) з утворенням 2-нітро-6-меркаптобензойної кислоти, що має жовте забарвлення. Інтенсивність забарвлення розчину пропорційна вмісту глутатіону в пробі [13].
Для визначення відновленої форми глутатіону використовували 20% гомогенат рослинних тканин, приготовлений на 0,3 М калій-фосфатному буфері з рН 7,5 (співвідношення тканина:буфер - 1:5). Отриманий гомогенат центрифугували 20 хв при 4000g. До 2 мл супернатанту додавали 3 мл осаджуючого реактиву (в 100 мл якого міститься 1,67 г HPO3, 0,2 г трилона Б, 30 г NaCl) та проводили повторне центрифугування впродовж 10 хв при 4000 g. Далі в кювету із довжиною оптичного шляху 1 см вносили 2 мл 0,3 М калій-фосфатного буфера, 0,05 мл 1 мМ розчину реактиву Елмана, 2 мл отриманого супернатанту і проводили вимірювання оптичної щільності при 412 нм на фотоелектроколориметрі КФК-3. За даними вимірювання оптичної щільності гомогенатів рослинних тканин і за калібрувальною кривою визначали концентрацію відновленої форми глутатіону. Вміст останньої (G, мМ/г сирої речовини) розраховували за формулою:
G = с/Mr x K;
де: с - концентрація глутатіону (мг/мл), Mr - відносна молекулярна маса глутатіону (307,3), K - коефіцієнт перерахунку на один грам сирої речовини (К = 5). Для побудови калібрувальної кривої використовували стандартні розчини відновленої форми глутатіону (0,1; 0,5 і 1 мг/мл) [13, 14].
Для вивчення активності глутатіонзалежних ферментів проводили гомогенізацію рослинного матеріалу в 0,1 М калій-фосфатному буфері, що містить 0,25 М сахарози, з наступним його центрифугуванням (11000g 1 год) при температурі 0-4оС. Осад, що містить ядра, фрагменти біомембран і хлоропласти відкидався, для досліджень використовували супернатант [12].
Активність глутатіонредуктази визначали згідно I.Carlberg [72] в нашій модифікації [12]. Реакційна суміш складалась з 0,5 мл 0,1 М калій-фосфатного буферу; 0,05 мл 2 мМ НАДН та 0,05 мл 20 мМ окисленого глутатіону. Реакція ініціювалася додаванням 0,05 мл супернатанту і реєструвалася спектрофотометрично за зміною оптичної щільності при довжині хвилі 340 нм.
Визначення активності глутатіонпероксидази проводили відповідно до методу С.М.Гуревича [17] модифікованому нами для рослинних організмів [12]. Швидкість окислювання НАДФН, що характеризує активність досліджуваного ферменту, визначалася спектрофотометрично за зміною оптичної щільності при довжині хвилі 340 нм. Реакція ініціювалася додаванням 0,2 мл 2,5 мМ перекису водню до робочої суміші, яка містила 0,2 мл 0,01 М EДTA, 0,1 мл 4 мМ НАДН, 0,2 мл 0,01 М відновленого глутатіону, 0,05 мл супернатанту та 1,2 мл 0,1 М калій-фосфатного буферу.
Вміст білка в гомогенатах рослинних тканин визначали за методом C.Greenberg [103] по реакції білка з бромфеноловим синім. Калібрувальну криву будували методом стандартних розведень сироваткового альбуміну білка.
Визначення біоморфометричних показників, концентрації важких металів і відновленої форми глутатіону, а також активності глутатіонзалежних ферментів проводили у 6 і 10-добових проростків, значення ІТ, КІ і ІРІ розраховувались на 10 добу експерименту.
Повторність у межах окремого варіанту досліду складала 20 рослин, аналітична повторність 4-кратна, біологічна повторність кожного досліду була 3-кратною. Статистична обробка експериментальних даних проводилася за загальноприйнятими методами параметричної статистики на 95% рівні значимості на PC Celeron 466 за Б.О.Доспеховим та Л.З.Р